馬 華,武麗萍

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是成年個體中與血管新生關(guān)系最為緊密的干細(xì)胞成分。

本研究擬采用血清藥理學(xué)、體外細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞熒光免疫等方法觀察中藥復(fù)方芪紅合劑對體外培養(yǎng)的EPCs數(shù)量及黏附功能的影響。旨在探討益氣活血化瘀中藥復(fù)方芪紅合劑可能的內(nèi)皮保護作用機制,同時為血管內(nèi)皮損傷及功能障礙相關(guān)性疾病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性 Wistar大鼠 12只,體重(200±11)g,山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;中藥芪紅合劑由黃芪、紅花、大黃等組成,上藥按比例稱取后,煎制濃縮為含生藥1.4 g/mL的合劑,山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中藥制劑室制備;FITC標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)、人纖維連接蛋白(HFN),Sigma公司;Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL),Molecular Probe公司;CD133,Ancell公司;CD34,BD公司,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF),Peprotech公司;淋巴細(xì)胞分離液,上海華精生物高科技有限公司;M199培養(yǎng)基,Gibco公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料研究所。

1.2 方法

1.2.1 制備含藥血清 取大鼠,隨機分成4組:中藥芪紅合劑組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)、對照組。分別給予7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg的芪紅合劑水煎劑及等容積的生理鹽水灌胃,每日2次,連續(xù)7d。最后1次灌藥前禁食不禁水12h,灌藥后2 h,心臟采血,室溫靜置2 h～4 h,待血凝固后,4℃冰箱過夜,3 000/min離心 10 min,提取血清,同組血清混勻,經(jīng)56℃、30 min滅活處理后,0.22 μ m濾膜過濾除菌,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 EPCs的分離、培養(yǎng) 采取10名健康成人志愿者空腹外周血(志愿者排除吸煙、近期外傷、手術(shù)史、皮膚潰瘍、糖尿病、心血管疾病等影響EPCs的因素),40 mL肝素抗凝。以2 000/min、1500/min離心5min～10min,重懸細(xì)胞于M 199培養(yǎng)基(含 20%胎牛血清,VEGF 10 μ g/L,FGF 2 μ g/L,青霉素 100 kU/L,鏈霉素100 kU/L)中,并接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。置37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)5 d后,PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d,PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,收集貼壁細(xì)胞。相差倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞生長情況。

1.2.3 EPCs的鑒定 ①細(xì)胞表型鑒定消化收集培養(yǎng)7 d的貼壁細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL。PBS洗滌2次,重懸于500 μ L的PBS中,加入 FITC標(biāo)記的CD133,PE標(biāo)記的 CD34,混勻,避光孵育30 min,上流式細(xì)胞儀檢測。②細(xì)胞熒光鑒定:收集的貼壁細(xì)胞與 Dil-acLDL(2.4 μ g/mL)在 37℃孵育 1 h后,2%多聚甲醛固定10 min,PBS漂洗后加入FITC-UEA-I(10 μ g/mL)并于37℃避光孵育 1 h,PBS洗滌。激光共聚焦顯微鏡下觀察,Dil-acLDL和FITC-UEA-I雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

1.2.4 實驗分組 貼壁細(xì)胞隨機分成4組。①對照組:先用不含胎牛血清的 M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,然后換含空白血清的M199培養(yǎng)液;②芪紅合劑含藥血清各劑量組(共3組):不含胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,再分別用含低、中、高劑量含藥血清的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.2.5 EPCs計數(shù) 將各組處理后的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化收集,制備成細(xì)胞懸液,接種于24孔培養(yǎng)板,每組設(shè)6個復(fù)孔和空白對照;用Dil-acLDL和FITC-UEA-I對細(xì)胞進行熒光染色,雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡下計數(shù)20個隨機選擇的高倍×200視野EPCs。

1.2.6 EPCs黏附能力檢測 用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞;將細(xì)胞懸液收集于離心管中,以800/min～1 000/min離心3 min～5 min,棄上清,加培養(yǎng)液,計數(shù);將同等數(shù)目的EPCs鋪在包被有HFN的24孔培養(yǎng)板,在37℃培養(yǎng)30 min,計數(shù)貼壁細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs的形態(tài)學(xué)改變 從外周血分離獲得的單個核細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈圓形,體積較小;2 d后出現(xiàn)成簇現(xiàn)象,可見少量細(xì)胞貼壁;4 d后細(xì)胞體積變大,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞數(shù)量增多,棄去懸浮細(xì)胞,可見少量梭形細(xì)胞和細(xì)胞集落形成,細(xì)胞集落中間為圓形細(xì)胞,周邊為梭形細(xì)胞,呈放射狀排列。培養(yǎng)過程中,貼壁細(xì)胞體積逐漸增大,7 d后長梭形狀的內(nèi)皮樣細(xì)胞明顯增多,并可觀察到梭形細(xì)胞首尾相連形成線狀結(jié)構(gòu)。

2.2 EPCs的鑒定 激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),DilacLDL陽性細(xì)胞顯示紅色熒光,主要集中在胞漿,FITC-UEA-I陽性細(xì)胞顯示綠色熒光,主要集中在胞膜。雙染色陽性細(xì)胞呈黃色為正在分化的EPCs。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志,結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞表達CD34陽性率為(38.36±3.70)%,CD133陽性率為(13.91±1.47)%。進一步從功能上證實了培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。

2.3 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs數(shù)量的影響 低、中劑量芪紅合劑顯著增加EPCs的數(shù)量,并且呈時間依賴性增加EPCs的數(shù)量,EPCs數(shù)量在低劑量芪紅合劑作用后24 h開始高于對照組,于72 h達到高峰;中劑量芪紅合劑作用后48 h開始高于對照組,于72 h達到高峰;高劑量芪紅合劑僅于作用72 h后高于對照組(P＜0.05)。此外,中藥芪紅合劑含藥血清在干預(yù)EPCs 48 h、72 h時,EPCs數(shù)量呈劑量相關(guān)性,低劑量組較中、高劑量組的 EPCs數(shù)量明顯增高(P＜0.05)。詳見表1。

表1 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs數(shù)量的影響(±s)

表1 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs數(shù)量的影響(±s)

組別 n 24 h 48 h 72 h對照組 6 37.5±7.5 44.8±4.9 46.1±3.1含藥血清低劑量組 6 55.0±4.61) 70.5±8.01) 82.7±9.41)含藥血清中劑量組 6 45.3±4.2 57.9±5.71)2) 63.3±6.31)2)含藥血清高劑量組 6 45.5±9.3 41.1±7.1 55.2±4.81)2)3)與對照組比較,1)P＜0.05;與含藥血清低劑量組比較,2)P＜0.05;與含藥血清中劑量組比較,3)P＜0.05

2.4 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs黏附功能的影響低、中劑量芪紅合劑顯著增加EPCs的貼壁細(xì)胞數(shù),并且呈時間依賴性增加,低劑量芪紅合劑作用后于24 h貼壁細(xì)胞數(shù)量開始高于對照組,于72 h達到高峰;中劑量芪紅合劑作用后于48 h貼壁細(xì)胞數(shù)量開始高于對照組,于72 h達到高峰,高劑量芪紅合劑僅于作用72 h后高于對照組(P＜0.05)。此外,中藥芪紅合劑含藥血清在干預(yù)48 h、72 h時,EPCs的貼壁數(shù)量呈一定的劑量相關(guān)性,低劑量組較中、高劑量組的數(shù)量明顯增高(P＜0.05)。詳見表2。

表2 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs黏附功能的影響(±s)

表2 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs黏附功能的影響(±s)

組別 n 24 h 48 h 72 h對照組 6 23.8±3.2 25.4±4.2 23.8±5.0含藥血清低劑量組 6 31.3±3.11)40.8±4.31) 48.4±4.41)含藥血清中劑量組 6 21.2±2.5 31.7±3.41)2) 40.4±3.81)2)含藥血清高劑量組 6 21.2±4.2 26.8±3.4 33.0±2.21)2)3)與對照組比較,1)P＜0.05;與含藥血清低劑量組比較,2)P＜0.05;與含藥血清中劑量組比較,3)P＜0.05

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙(endothelial cell dysfunction,ED)是多種心腦血管疾病發(fā)生的共同病理生理改變,其典型病理生理變化是導(dǎo)致血管痙攣、血管異常收縮、血栓形成及血管增生。在動脈粥樣硬化、心肌缺血、組織缺血、缺氧再灌注損傷等疾病發(fā)展中存在著不同程度的內(nèi)皮損傷[1]。高血壓、高血脂、吸煙、糖尿病、動脈粥樣硬化家族史、高齡、等危險因素都可以造成ED[2-4]。1997年,Asahara等[5]首次分離并證實人類出生后的外周循環(huán)血液中,存在能分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞的 EPCs。EPCs在成年機體的血管新生中起重要作用,新生血管中25%的內(nèi)皮細(xì)胞是由EPCs分化而來的。研究顯示,中醫(yī)氣虛血瘀證與內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其功能障礙之間有密切的聯(lián)系,氣虛血瘀可能為血管內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)的主要發(fā)病機制之一[6]。目前臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),某些益氣活血化瘀類中藥對于冠心病、糖尿病、周圍血管病、手術(shù)及創(chuàng)傷多種疾病的內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)有良好的療效,具有一定的內(nèi)皮細(xì)胞保護作用[7,8]。益氣活血類中藥對于內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞EPCs是否有一定的作用,其內(nèi)皮細(xì)胞保護作用機制是否與EPCs途徑有關(guān)值得探討。此外,尋找體內(nèi)動員EPCs或體外促進其向內(nèi)皮系增殖分化的藥物能夠?qū)χ委熜哪X血管病、周圍血管病變、糖尿病大血管病變、及手術(shù)及創(chuàng)傷等內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮功能障礙及血管新生相關(guān)性疾病意義重要。

中藥復(fù)方芪紅合劑是臨床治療氣虛血瘀癥的經(jīng)驗方。由黃芪、紅花、大黃等組成。諸藥配伍,味少力專,共達益氣活血,通脈祛瘀之功。臨床運用芪紅合劑對冠心病、周圍血管病變、糖尿病大血管病變、腦血管病等疾病的防治效果滿意,能有效改善癥狀,延緩病情的進展。實驗過程中,順利完成了體外誘導(dǎo)、增殖和分化人外周血EPCs,用制備的低、中、高劑量中藥芪紅合劑含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的EPCs,進一步觀察了益氣活血化瘀中藥復(fù)方芪紅合劑對人外周血EPCs體外數(shù)量和功能的影響。運用中藥血清藥理學(xué)和體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的方法進行研究,具有一定的創(chuàng)新性。中藥復(fù)方多數(shù)是通過口服而起作用,但是中藥粗制劑中含有大量雜質(zhì),若直接將中藥粗制劑加入體外反應(yīng)體系進行實驗,其滲透性、pH值、蹂質(zhì)、無機鹽等許多非特異性理化因素將嚴(yán)重干擾實驗結(jié)果,因而其實驗結(jié)果的可靠性和科學(xué)性難以得到認(rèn)可[9]。中藥粗制劑經(jīng)口服吸收后,再用含藥血清進行體外實驗,不僅能反映藥物中可吸收部分的直接作用,也可反映藥物在機體作用下形成的代謝產(chǎn)物和藥物誘生的內(nèi)源性生成物的間接結(jié)果,真實反映藥物在體內(nèi)的藥理作用,使體外試驗?zāi)茌^好地重復(fù)在體試驗的結(jié)果。

本實驗采用低、中、高不同劑量的芪紅合劑含藥血清對EPCs進行干預(yù)研究,結(jié)果顯示,芪紅合劑可以增加EPCs的數(shù)量,并能改善EPCs的黏附功能,其影響呈一定的量效、時效關(guān)系。芪紅合劑對EPCs數(shù)量及黏附功能的影響隨劑量增高而有所降低,而在同一劑量組中,芪紅合劑對EPCs數(shù)量及黏附功能的影響于24 h作用明顯,于72 h達到高峰。提示中藥芪紅合劑可能具有一定的動員自體EPCs數(shù)量和黏附功能的作用,其具體的作用途徑有待進一步探討。

[1] Ubo SH,Rector TS,Ban KA,et al.Endothelium-dependent vasodilation in attenuated in patients with heart failure[J].Circulation,1991,85:1589.

[2] Puranik R,Celermajer DS.Smoking and endothelial function[J].Prog Cardiovasc Dis,2003,45(6):443-584.

[3] Raza J,Movahed A.Current concepts of cardiovascular diseases in diabetes mellitus[J].Int J Cardiol,2003,89(223):123-134.

[4] Woodman CR,Price EM,Laughlin MH.Selected contribution:Aging impairs nitric oxide and prostacyclin-mediation of endotheliumdependent dilation in soleus feed arteries[J].J Appl Phy siol,2003,95(5):2164-2170.

[5] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.

[6] 李曉,姜萍.血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與血瘀證[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(2):154-156.

[7] 孫兆責(zé),陳利國.丹參對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的雙向調(diào)節(jié)作用[J].中華實用中西醫(yī)雜志,2005,18(4):500-503.

[8] 馬麗紅,阮英茆,焦增綿,等.益氣活血通絡(luò)中藥對不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(6):560-561.

[9] 張金梁,崔志清.中藥血清藥理學(xué)實驗方法的研究探微[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(12):2271-2272.