李國菁,嚴(yán)浩成,王行寬,孫桂香

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是一種具有多種生物學(xué)活性的多肽生長因子。它不僅能保護(hù)神經(jīng)元,促進(jìn)神經(jīng)生長,還能減小腦缺血后梗死體積、恢復(fù)神經(jīng)功能等作用,被認(rèn)為將是最具有臨床應(yīng)用價(jià)值的神經(jīng)營養(yǎng)因子[1]。

益氣活血之補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性中風(fēng)公認(rèn)的有效方劑,臨床和動(dòng)物研究證實(shí)對(duì)腦組織細(xì)胞的形態(tài)和功能具有多方面的作用[2-4],為缺血性中風(fēng)各期通用之方,但該方僅針對(duì)腦絡(luò)瘀阻而言,并無補(bǔ)腎益精生髓,充養(yǎng)髓海,濡潤腦絡(luò)之功,故研究者于臨證之時(shí),常用六味地黃湯合補(bǔ)陽還五湯治之,共奏補(bǔ)腎益精以健腦,益氣活血以通絡(luò)之功,可明顯提高療效。本研究將兩方合用,觀察其對(duì)缺血不同時(shí)段bFGF的影響,探討合方抗腦缺血損傷的機(jī)制及兩方之間是否存在協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康SD老齡大鼠,(20～22)月齡,雄性,體重400 g～550 g,普通級(jí),由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。老齡SD大鼠先按體重大小分層,再采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組,即健腦通絡(luò)湯組(A+B組)、六味地黃湯組(A組)、補(bǔ)陽還五湯組(B組)、模型組、假手術(shù)組。

1.2 藥物與試劑 健腦通絡(luò)湯、六味地黃湯、補(bǔ)陽還五湯(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院制劑室提供,生藥含量分別為2.42 g/mL、0.83 g/mL、1.58 g/mL)。bFGF免疫組化試劑盒,由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 主要儀器 分析天平(AB204-S,臺(tái)灣),電子天平(YY3002,上海精宏科學(xué)儀器有限公司),超低溫冰箱(38257 HO/REV-B,美國),高速冷凍離心機(jī)(TGL16G-SM 型,德國),電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),石蠟切片機(jī)(FINESSE 325,Thermo Shandon),Leica Microsystems(LEICA DM LBZ,德國),METT LER(L006 OSI,TOLEDO),BIOMEDICAL FREEZER(MCF-V5411,SANYO Electric Biomedical Co.Ltd),Motic攝像系統(tǒng)(B5 professional series,臺(tái)灣),MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)(北航)。

1.4 模型制作方法 按照改良Haruo Nagasawa方法[5]建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)持續(xù)腦缺血模型。造模成功大鼠分別于缺血后24 h、72 h、7 d斷頭處死。該模型成功的標(biāo)志為大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征和對(duì)側(cè)以前肢為重的偏癱。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6],分別于術(shù)后24 h、72 h、7 d進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,滿分為11分。分?jǐn)?shù)越高,動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。評(píng)分＞5分,則表明模型成功,低于5分則予以剔除。

1.6 給藥方式及途徑 藥物劑量換算參照劑量體表面積換算法[7],各組動(dòng)物均在麻醉0.5 h之前半量給藥1次,麻醉清醒6 h后再給另一半,以后每天分別于08:00～09:00,16:00～17:00兩次灌胃。

1.7 取材及測定 各組大鼠分別在缺血24 h、72 h、7 d取材。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)麻醉成功后,打開胸腔,用生理鹽水200 mL經(jīng)左心室快速?zèng)_洗,繼用4%多聚甲醛400 mL灌流固定。取腦后置入4%多聚甲醛內(nèi)固定6 h。常規(guī)脫水,石蠟包埋,進(jìn)行冠狀切片,每隔200 μ m連續(xù)取2張,保存?zhèn)溆谩FGF免疫組化嚴(yán)格按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.8 圖像及統(tǒng)計(jì)分析 采用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)軟件包進(jìn)行圖像分析,每張切片在10目鏡×40物鏡的顯微鏡下,分別在缺血灶、缺血邊緣區(qū)、海馬、大腦皮層及皮層下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)。應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 模型bFGF陽性細(xì)胞總數(shù)的判定 假手術(shù)組中僅發(fā)現(xiàn)少量的bFGF免疫陽性細(xì)胞表達(dá),呈棕黃色,以膠質(zhì)細(xì)胞為主,神經(jīng)細(xì)胞也有少量表達(dá)。模型組在缺血后24 h后,bFGF免疫陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多,主要分布在缺血周圍區(qū)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。bFGF陽性細(xì)胞表達(dá)24 h時(shí)達(dá)高峰,72 h時(shí)開始下降,7 d時(shí)只有少量表達(dá)。模型組bFGF免疫表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較,24 h、72 h均有明顯增加(P＜0.01),但在缺血后7 d時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 模型組與假手術(shù)組bFGF細(xì)胞總數(shù)比較(±s)

表1 模型組與假手術(shù)組bFGF細(xì)胞總數(shù)比較(±s)

組別 n 24 h 72 h 7 d模型組 8 101.88±21.21 75.13±22.3139.75±12.29假手術(shù)組 8 45.26±7.17 36.42±5.25 35.08±5.06 t值 7.152 4.772 0.963 P ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分比較 缺血后24 h、72 h、7 d的神經(jīng)功能評(píng)分,各法與不使用該法進(jìn)行比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);各法及模型組之間進(jìn)行2×2的析因分析,A法為六味地黃丸,B組為補(bǔ)陽還五湯組,A+B組為六味地黃丸合補(bǔ)陽還五湯組。A、B兩法存在交互作用,比單獨(dú)用A法或B法效應(yīng)強(qiáng)。從神經(jīng)功能評(píng)分的4個(gè)均值來看,模型組＞A＞B＞A+B,顯示出不用A、B兩法的模型組神經(jīng)功能評(píng)分最高,經(jīng)A法干預(yù)的評(píng)分稍低,經(jīng)B法干預(yù)的神經(jīng)功能評(píng)分比 A法低,經(jīng) A、B兩法同時(shí)干預(yù)的神經(jīng)功能評(píng)分最低。六味地黃湯和補(bǔ)陽還五湯合用能協(xié)同降低急性持續(xù)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分,其作用優(yōu)于單用,即健腦通絡(luò)湯優(yōu)于六味地黃湯及補(bǔ)陽還五湯;其中單用補(bǔ)陽還五湯優(yōu)于單用六味地黃湯。詳見表2。

表2 各治法對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分的方差分析(±s)

表2 各治法對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分的方差分析(±s)

組別 n 24 h評(píng)分(±s F值 P 72 h評(píng)分7 d評(píng)分F值 P(±s F值(±s P A組 16 9.00±0.54 7.177 ＜0.05 4.00±0.76 15.831 ＜0.01 1.25±0.46 14.000 ＜0.01 B組 16 8.75±0.46 14.975 ＜0.01 3.75±0.89 22.436 ＜0.01 0.88±0.84 28.571 ＜0.01 A+B組 8 7.75±0.46 4.342 ＜0.05 3.13±1.13 4.344 ＜0.05 0.50±0.54 4.571 ＜0.05模型組 8 9.13±0.84 6.00±0.90 2.63±0.74

2.3 腦組織缺血區(qū)bFGF免疫組化分析 缺血后24 h、72 h、7 d的bFGF陽性細(xì)胞總數(shù)表達(dá),各法與不使用該法進(jìn)行比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各法及模型組之間進(jìn)行2×2的析因分析,表明A、B兩法存在交互作用,比單獨(dú)用A法或B法細(xì)胞總數(shù)表達(dá)多。且從表中表達(dá)的陽性細(xì)胞總數(shù)的4個(gè)均值來看,模型組＜A＜B＜A+B,顯示出不用 A、B兩法的模型組陽性細(xì)胞總數(shù)表達(dá)得最少;經(jīng)A法干預(yù)的陽性細(xì)胞總數(shù)表達(dá)得稍高;經(jīng)B法干預(yù)后所表達(dá)的陽性細(xì)胞總數(shù)比A法的高,經(jīng)A、B兩法同時(shí)干預(yù)后所表達(dá)的陽性細(xì)胞總數(shù)最高。六味地黃湯和補(bǔ)陽還五湯合用能協(xié)同提高急性持續(xù)腦缺血大鼠的bFGF陽性細(xì)胞總數(shù),使其表達(dá)增強(qiáng),其作用優(yōu)于單用,即健腦通絡(luò)湯優(yōu)于六味地黃湯及補(bǔ)陽還五湯;其中單用補(bǔ)陽還五湯優(yōu)于單用六味地黃湯。詳見表3。

表3 各治法對(duì)bFGF陽性細(xì)胞總數(shù)表達(dá)影響的方差分析(±s)

表3 各治法對(duì)bFGF陽性細(xì)胞總數(shù)表達(dá)影響的方差分析(±s)

組別 n 24 h評(píng)分(±s F值 P 72 h評(píng)分7 d評(píng)分(±s F值 P(±s F值P A組 16 165.25±27.61 18.708 ＜0.01 121.63±20.97 11.123 ＜0.01 68.25±15.53 8.653 ＜0.01 B組 16 185.50±24.32 44.897 ＜0.01 148.88±24.55 47.476 ＜0.01 102.38±11.28 87.727 ＜0.01 A+B組 8 195.88±22.86 9.662 ＜0.01 153.50±18.44 7.462 ＜0.05 105.13±19.59 5.875 ＜0.05模型組 8 101.88±21.21 75.13±22.31 39.75±12.29

3 討 論

近年來發(fā)現(xiàn),腦缺血引起一系列損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的同時(shí),亦觸發(fā)機(jī)體多種保護(hù)因子的表達(dá),在不同環(huán)節(jié)拮抗損傷作用,修復(fù)受損神經(jīng)元。神經(jīng)營養(yǎng)因子雖然能夠從提高自由基清除劑的活力、拮抗EAA的神經(jīng)毒性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、抑制凋亡因子表達(dá)、增強(qiáng)蛋白激酶C(PKC)的活性等多途徑對(duì)抗腦缺血損傷并促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的修復(fù),但由于神經(jīng)營養(yǎng)因子多為大分子肽,難以通過血腦屏障,因此外周給藥難以到達(dá)作用部位,而腦內(nèi)給藥又會(huì)加重缺血損傷,而且操作非常復(fù)雜。所以,充分誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達(dá),可能是進(jìn)行腦保護(hù)的重要途徑。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎益氣活血中藥能從多方面改善缺血性中風(fēng)的病理狀態(tài),多環(huán)節(jié)進(jìn)行腦細(xì)胞的保護(hù),促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

健腦通絡(luò)湯根據(jù)缺血性中風(fēng)以腎精氣虧虛為本,腦絡(luò)瘀阻為標(biāo)之說[8-10],擷取六味地黃丸合補(bǔ)陽還五湯,命名為“健腦通絡(luò)湯”,方中以熟地黃、黃芪為君,前者滋陰補(bǔ)腎、填精益髓以健腦,后者大補(bǔ)氣陽,令氣旺血行,冀瘀去絡(luò)通以治缺血之本。山萸肉補(bǔ)養(yǎng)肝腎,山藥補(bǔ)益脾之氣陰,川芎行氣活血,歸尾長于活血,且有化瘀而不傷血之妙,四者共為臣藥,除加強(qiáng)君藥的補(bǔ)腎作用外,尚有兼顧肝脾、行氣活血,使腎之精氣易于上行輸注于腦。赤芍、桃仁、紅花助歸尾活血祛瘀,茯苓淡滲脾濕,澤瀉利濕泄?jié)?并防熟地之滋膩,丹皮清泄相火,并制山萸肉之溫澀,以上共為佐藥。地龍清熱熄風(fēng),通絡(luò)利尿,用之一則引藥入病變之經(jīng)絡(luò);一則兼以清熱熄風(fēng);一則使腦中留飲下行從小便而去,寓“病在上而取之下”之意,列為使藥。該方通補(bǔ)并施,溫清兼顧,補(bǔ)而不戀邪,通而不傷正,通過補(bǔ)腎以健腦;化瘀以通絡(luò),共奏補(bǔ)腎健腦化瘀通絡(luò)之功。

bFGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種,具有多種生物活性,可促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存活及突起生長,拮抗興奮性氨基酸毒性,對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)鈣超載,拮抗自由基,從而減輕以上各因素引起的神經(jīng)元損傷。bFGF對(duì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織均有營養(yǎng)作用,因此被認(rèn)為是最具有臨床應(yīng)用價(jià)值的神經(jīng)營養(yǎng)因子,而且已肯定其對(duì)神經(jīng)保護(hù)的作用[11]。

在正常情況下,腦內(nèi)僅有少量bFGF表達(dá),但在短暫腦缺血后其可能作為一種自我保護(hù)反應(yīng)而表達(dá)明顯增多。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組中神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有少量的bFGF陽性細(xì)胞表達(dá),以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)為主。模型組在缺血24 h后,bFGF免疫陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多,主要為缺血區(qū)周圍存活的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;缺血72 h后,bFGF免疫陽性細(xì)胞表達(dá)開始下降;缺血7 d后,bFGF只有少量表達(dá)。模型組bFGF免疫表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較,缺血后24 h,72 h均有明顯增加(P＜0.05或P＜0.01),但在缺血后7 d時(shí)沒有明顯差異。這說明缺血性腦損傷能誘導(dǎo)內(nèi)源性bFGF的表達(dá),且其表達(dá)呈一定的時(shí)間規(guī)律性。本研究還發(fā)現(xiàn),應(yīng)用藥物后,內(nèi)源性bFGF顯著上調(diào),神經(jīng)功能評(píng)分相應(yīng)減輕,提示中藥能通過啟動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)進(jìn)而加強(qiáng)腦缺血后的修復(fù)過程,這可能是其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。補(bǔ)腎益氣活血的健腦通絡(luò)湯這一作用最為明顯,補(bǔ)陽還五湯次之,六味地黃湯又次之,兩者之間存在協(xié)同作用。

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