姚 雷,梁月琴,任俊杰,陳 媛,武冬梅,王 君,張軒萍,許慧玉,張 軍

血管緊張素Ⅱ1受體(AT1)拮抗劑(ARBs)是目前國(guó)際上推薦的五大類降壓藥中作為降壓治療的一線藥物之一。在國(guó)內(nèi)應(yīng)用很普遍,它是繼血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)之后的一類作用于腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的重要藥物。替米沙坦作為對(duì)AT1親和力最強(qiáng)的ARBs,它選擇性、不可逆轉(zhuǎn)地拮抗AngⅡ的AT1受體而不影響包括心血管調(diào)節(jié)的其他受體系統(tǒng)[1]。它可以松弛血管平滑肌,增加鹽類排泄[2]。現(xiàn)有的研究認(rèn)為,替米沙坦主要是通過拮抗AT1受體而發(fā)揮舒張血管的作用,為了研究替米沙坦在舒張血管平滑肌的過程中是否有AT1受體以外的機(jī)制參與,本實(shí)驗(yàn)從調(diào)節(jié)血管張力的角度出發(fā),觀察了替米沙坦對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 替米沙坦:江蘇中邦制藥有限公司,批號(hào)20081206;左旋硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME):Sigma公司,批號(hào) 511K1351;吲哚美辛(Indomethacin,Indo):Sigma公司,批號(hào) 065N7764;去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE):Sigma公司,批號(hào)086K1540;其余均為化學(xué)試劑國(guó)產(chǎn)分析純。BL-420F計(jì)算機(jī)生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);張力換能器(FT-100,成都泰盟科技有限公司);數(shù)字式超級(jí)恒溫浴鍋(HH-501,常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,月齡2個(gè)月～3個(gè)月,體重250g～300g,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)條件:每籠2只,自由攝食飲水,飼養(yǎng)溫度為20℃～25℃,相對(duì)濕度40%～70%。用山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)塊料飼養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本制備 以斷頭法處死大鼠,迅速打開胸腔,分離胸主動(dòng)脈,將取下的胸主動(dòng)脈置入預(yù)冷預(yù)先通氧、pH值為7.4的生理鹽溶液(PSS)中,成分為:NaCl 144 mmol/L,KCl 5.8 mmol/L,MgCl21.2mmol/L,CaCl22.5mmol/L,Glucose11.1mmol/L,HEPES 5 mmol/L。去除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織,將動(dòng)脈剪成2 mm～3 mm的血管環(huán),血管環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤從管腔穿過,水平懸掛在浴管內(nèi),下方固定,上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器,經(jīng)BL-420F計(jì)算機(jī)生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力變化。浴管內(nèi)含有通以100%氧、pH值為7.4、37℃的生理鹽溶液,前負(fù)荷調(diào)為2 g,平衡1 h后開始實(shí)驗(yàn)。每20 min換一次營(yíng)養(yǎng)液。所有動(dòng)脈環(huán)用60 mmol/L-KCl PSS液2次刺激,收縮穩(wěn)定后,開始正式實(shí)驗(yàn)。去內(nèi)皮的實(shí)驗(yàn),將修剪干凈的胸主動(dòng)脈環(huán)兩端固定,用與血管內(nèi)徑相適的棉棒從管腔擦過,連續(xù)2次。血管環(huán)懸掛穩(wěn)定1 h后,用60 mmol/L KCl HEPES液刺激,達(dá)到坪值后加入 Ach(10-5mol/L),舒張幅度不超過收縮幅度的5%時(shí)認(rèn)為內(nèi)皮去除完全,可開始實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法 ①張力平衡后,用NE(1×10-6mol/L)分別預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管,達(dá)到坪值后,以10 min的間隔累積加入1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L的替米沙坦,對(duì)照組加入等容量的生理鹽水,描記張力曲線。②張力平衡后,同樣用NE(1×10-6mol/L)預(yù)收縮血管,達(dá)到坪值后,加入內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑L-NAME(1×10-4mol/L)、環(huán)氧合酶抑制劑Indo(1×10-5mol/L)再次達(dá)到坪值后,以10 min的間隔累積加入1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L的替米沙坦,描記張力曲線。③1、2、3號(hào)浴管內(nèi)血管穩(wěn)定后加入NE10-6mol/L,血管環(huán)收縮達(dá)坪值后用PSS液洗脫,并平衡1 h,然后用無鈣PSS液連續(xù)沖洗3次,并孵浴 3 min,之后在 1、2、3號(hào)浴管內(nèi)分別加入溶劑、替米沙坦 1×10-8mol/L、替米沙坦 1×10-5mol/L,孵浴20 min,然后分別加入NE1×10-6mol/L,可見血管環(huán)產(chǎn)生迅速而短暫的收縮,待其舒張并平穩(wěn)后,向各管內(nèi)加入CaCl22.5 mmol/L,可見血管環(huán)再次收縮并達(dá)峰值,描記張力曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用兩獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 替米沙坦對(duì)NE預(yù)收縮的大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的直接舒張作用以及內(nèi)皮對(duì)其作用的影響 替米沙坦對(duì)NE(1×10-6mol/L)預(yù)收縮的離體胸主動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用,其logEC50為-7.1±0.7,與溶劑對(duì)照組相比,張力變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。替米沙坦對(duì)NE(1×10-6mol/L)預(yù)收縮的去內(nèi)皮離體胸主動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用,其logEC50為-6.2±0.3,與內(nèi)皮完整組相比,張力變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 替米沙坦和生理鹽水對(duì) NE預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的作用以及替米沙坦對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管的作用

2.2 阻斷劑對(duì)替米沙坦舒血管作用的影響 L-NAME孵浴后,替米沙坦的舒張作用減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。Indo孵浴后,NE誘發(fā)的血管張力變化與無阻斷藥時(shí)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖2。

圖2 L-NAME、Indo對(duì)替米沙坦在NE預(yù)收縮大鼠胸主動(dòng)脈舒張作用中的影響

2.3 替米沙坦對(duì)NE在無鈣液中的縮血管效應(yīng)的影響 在無鈣PSS液中,分別加入替米沙坦1×10-8mol/L、1×10-5mol/L,孵 浴20min后,加入NE10-6mol/L,血管環(huán)產(chǎn)生迅速而短暫的收縮,收縮幅度和溶劑組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),待血管環(huán)舒張并平穩(wěn)后,加入CaCl2至2.5 mmol/L,血管環(huán)再次收縮,替米沙坦組收縮幅度與溶劑組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖3。

圖3 替米沙坦對(duì)NE在無鈣液中以及CaCl2中縮血管效應(yīng)的影響

3 討 論

替米沙坦是一種新型、長(zhǎng)效、低毒、高選擇性的二苯四咪唑類AngⅡ1型受體(AT1)拮抗劑[1-3],它通過抑制 AT1,降低總外周血管阻力,增加血管壁的順應(yīng)性,降低血管僵硬性,從而對(duì)心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要的保護(hù)作用[4]。

研究表明替米沙坦可能通過促進(jìn)ACE22表達(dá)及拮抗AngⅡ?qū)CE22表達(dá)的抑制作用這些對(duì)AT1的阻斷作用以外的途徑來產(chǎn)生降壓及心血管保護(hù)作用[5]。為了研究替米沙坦在舒張血管平滑肌的過程中是否AT1受體以外的機(jī)制參與,本實(shí)驗(yàn)主要觀察替米沙坦對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的直接舒張作用。

實(shí)驗(yàn)表明,替米沙坦對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)均有舒張作用,且去除內(nèi)皮后,其舒張作用減弱。因此,替米沙坦對(duì)血管的舒張作用由兩部分組成,部分作用于內(nèi)皮的舒張機(jī)制,部分直接作用于血管平滑肌。

內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管舒張物質(zhì)在血管平滑肌張力的調(diào)節(jié)過程中起重要的作用[6,7],即EDRF/NO、前列腺環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮細(xì)胞超極化因子(EDHF)。其中NO是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的最重要的舒血管物質(zhì),對(duì)于血管基礎(chǔ)張力的維持至關(guān)重要[6,8]。內(nèi)皮源性NO釋放受抑制導(dǎo)致內(nèi)皮相關(guān)的血管舒張作用減弱[9]。NO可通過NO-sGC-cGM P途徑,使鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)激活促使cGMP生成,后者則進(jìn)一步作用于cGMP依賴性蛋白激酶使Ca2+內(nèi)流減少,增加Ca2+-ATP酶對(duì)Ca2+的攝取,或直接使收縮蛋白去磷酸化舒張血管[10]。eNOS抑制劑 LNAM E處理血管后,發(fā)現(xiàn)在NE預(yù)收縮的基礎(chǔ)上替米沙坦的舒張血管作用部分被阻斷,提示NO途徑可能參加替米沙坦的舒張血管作用。另一舒血管物質(zhì)是PGI2是由COX催化花生四烯酸產(chǎn)生的,加入環(huán)氧合酶抑制劑Indo后,替米沙坦的舒張血管作用未被阻斷,提示PGI2未參與替米沙坦的舒血管作用。

Ca2+在血管平滑肌收縮中起關(guān)鍵作用[11],血管平滑肌收縮所需要的Ca2+源于細(xì)胞外內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)釋放。研究表明,NE在無Ca2+PSS液中引起的短暫收縮是細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的結(jié)果[12],加入CaC12后引起血管平滑肌進(jìn)一步收縮被認(rèn)為是細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的結(jié)果[13]。本實(shí)驗(yàn)采用無Ca2+液和復(fù)Ca2+液的實(shí)驗(yàn)方法,發(fā)現(xiàn)高濃度和低濃度的替米沙坦都不能抑制NE在無Ca2+液中所引起的血管平滑肌短暫收縮和復(fù)Ca2+后的持久收縮,證明了替米沙坦不通過對(duì)血管環(huán)外鈣依賴性收縮和內(nèi)鈣依賴性收縮的影響來發(fā)揮舒血管作用。

替米沙坦對(duì)NE預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)具有濃度依賴性的舒張作用,其舒張反應(yīng)可能有內(nèi)皮依賴性,與內(nèi)皮產(chǎn)生的NO有關(guān),與PGI2的合成無關(guān),不通過抑制外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放發(fā)揮舒張作用。

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