內(nèi)蒙古工業(yè)大學化工學院 高美云 張 通

農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點實驗室

中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所基因室 劉 賓 滕 達 田子罡 王建華＊

與棉籽粕、菜籽粕、花生粕相比，豆粕不僅蛋白質(zhì)含量高（約44%），還具有氨基酸平衡（賴氨酸含量高達2%以上）、適口性好、消化率高（85%）等特點；與魚粉、肉骨粉、血漿蛋白粉等動物源性蛋白質(zhì)相比，豆粕具有供應充足、不易被病原菌污染或氧化腐敗，安全系數(shù)高等特點。但是，豆粕中存在許多抗營養(yǎng)因子（如胰蛋白酶抑制劑、脲酶、抗原蛋白、皂甙等），這些抗營養(yǎng)因子對幼齡動物腸道結構具有較大的破壞作用，會引起腹瀉等疾病。因此，利用物理、化學、生物學方法去除豆粕中的抗營養(yǎng)因子，有利于提高其營養(yǎng)價值。

1 豆粕抗營養(yǎng)因子

1.1 抗原蛋白 截至2009年5月19日國際免疫學聯(lián)合會（IUIS）認定的大豆過敏原共34種，其中32種來自栽培大豆，2種來自野生型大豆（http://www.allergenoline.org/）。這些抗原蛋白的分子量范圍為7.0～71 ku。在動物營養(yǎng)研究中，根據(jù)含量和致敏度，認為7S球蛋白組分中的Gly m Bd 60K、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K、11S 球蛋白是豆粕中主要致敏蛋白，這4種蛋白質(zhì)都是大豆種子儲藏蛋白（Ogawa等，2000）。

1.1.1 抗原蛋白特征 Gly m Bd 60K是β-伴球蛋白（β-conglycinin）的 α-亞基，能被 25%過敏患者血清識別（方旭前等，2006）。β-伴球蛋白占大豆蛋白質(zhì)的30%，是高豐度蛋白質(zhì)，也是最重要的豆粕致敏原。β-伴球蛋白的α亞基與α′亞基、α亞基與β亞基、α′亞基與β亞基間不變氨基酸殘基的比例分別為90.4%、76.2%和75.5%，但識別60K的IgE抗體同β-伴球蛋白中的另兩個亞基 α′和 β 并無交叉反應（Ogawa等，2000）。

Gly m Bd 30K蛋白幾乎存在于所有大豆品種，尚未發(fā)現(xiàn)自然缺失該蛋白的品種（Yaklich等，1999）。Gly m Bd 30K在大豆中是一種低含量蛋白質(zhì)組分，其含量小于大豆蛋白質(zhì)總含量的1%（Eliot等，2003），但能引起65%大豆過敏患者發(fā)生過敏反應（Helm 等，2000；1998），是大豆中致敏性最強的儲藏蛋白。Gly m Bd 30K與大豆種子34K種子空泡蛋白P34相同，故名P34，其功能尚不清楚，也未見關于Gly m Bd 30K的酶活性相關報道。30K至少有14個抗原表位。

Gly m Bd 28K是豆粕中存在的另一重要過敏原，含量低于30K蛋白，為低豐度蛋白。通過用大豆致敏患者血清作的免疫檢測發(fā)現(xiàn)，Gly m Bd 28K與其C端23KD片段都具免疫原性（Ping等，2004）。Gly m Bd 28K是否被加工成兩條單獨肽鏈，以及這兩條肽鏈是否像大豆球蛋白一樣經(jīng)疏水作用而結合仍不清楚（Mills等，2002）。根據(jù)都可與IgE抗體結合的特點，推測這兩種肽鏈在體內(nèi)會是結合的。

1.1.2 抗原蛋白的作用機制 幼齡動物腸道發(fā)育不成熟，采食含大豆日糧后，大部分抗原蛋白被降解為肽和氨基酸，小部分抗原蛋白會穿過小腸上皮細胞間隙或上皮細胞內(nèi)的空隙完整地進入血液和淋巴，刺激腸道免疫組織，產(chǎn)生包括特異性抗原抗體反應和T淋巴細胞介導的遲發(fā)性過敏反應，前者刺激肥大細胞釋放組胺，引起上皮細胞通透性增加和黏膜水腫，后者主要引起腸道形態(tài)變化。過敏反應將使幼齡動物血清中大豆抗原特異性抗體滴度升高，小腸絨毛萎縮，隱窩細胞增生（Li等，1990），同時導致消化吸收障礙、生長受阻以及過敏性腹瀉。

1.2 胰蛋白酶抑制劑 大豆中胰蛋白酶抑制劑（TI）含量約為2%，是大豆主要抗營養(yǎng)因子之一，按其結構可分為2種，即Kunitz胰蛋白酶抑制劑（簡稱KTI）和Bouman-Birk胰蛋白酶抑制劑（簡稱BBI）。KTI含量約1.4%，主要抑制動物體內(nèi)分泌的胰蛋白酶活性；BBI含量約0.6%，可同時抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。當動物采食含胰蛋白酶抑制劑的大豆飼料后，腸道中蛋白酶作用被抑制，阻礙動物對飼料蛋白質(zhì)的消化吸收，還造成胰腺本身的補償性反應，分泌過多胰腺酶，導致必需氨基酸的內(nèi)源性損失；另外，還可引起腸胃中毒、胰腺腫大，消化吸收功能失調(diào)，抑制生長，尤其對幼齡動物影響大（Perez-Maldonado，2003）。

1.3 大豆凝血素 大豆凝血素是一種高親和性的糖蛋白，在大豆中含量約3%，其在動物腸道中不易被蛋白酶水解，它通過與小腸壁上皮細胞表面特異性受體相結合，損壞小腸壁刷狀緣黏膜結構，干擾消化酶分泌，抑制腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，降低蛋白質(zhì)利用率，使動物生長受阻甚至停滯（Liener，2000）。 另外，凝血素還對腸壁、腸道細菌及免疫機能產(chǎn)生一定影響，引起腸腔糜爛，微絨毛變短萎縮，腸細胞退化，病變周圍組織水腫和杯狀細胞肥大增生等。Palacios等（2004）用除去凝集素和胰蛋白酶抑制因子的熟大豆飼喂雛雞和幼豬，結果發(fā)現(xiàn)這兩種抗營養(yǎng)因子對幼豬的影響大于雛雞，因此大豆凝集素對動物生產(chǎn)性能的影響隨動物年齡、物種等因素而異。

1.4 低聚糖 大豆中低聚糖含量為5%～6%，主要包括棉籽糖、水蘇糖等，它具有營養(yǎng)和抗營養(yǎng)雙重作用，一方面低聚糖又稱為胃腸脹氣因子，由于人或動物缺乏α-半乳糖苷酶不能水解棉籽糖與水蘇糖，攝入的α-半乳糖苷不能被消化吸收，當它們進入大腸后，經(jīng)細菌發(fā)酵，會產(chǎn)生CO2、H2及少量CH4，引起消化不良、腹脹、腸鳴、腹瀉等現(xiàn)象，同時也降低了含α-半乳糖苷飼料的消化能值。另一方面它又是益生素，能被雙歧桿菌等有益微生物特異性利用，促進有益菌增殖，有益菌的增殖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乳酸和短鏈脂肪酸，降低腸道pH值，從而抑制了病原菌生長，增強了動物的抗病性能（張樹清等，2007；徐超斗等，2005）。

1.5 植酸 大豆中80%的磷以植酸態(tài)存在。植酸能和飼料中的礦物質(zhì)元素，如鐵、鋅、錳等結合形成穩(wěn)定的化合物，降低這些成分的消化利用率。植酸能與蛋白質(zhì)結合，降低其溶解性，影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)功能。植酸還可與淀粉酶、胰酶和胃蛋白酶結合，抑制其活性并可造成磷污染。Veum等（2002）總結了用低植酸豆粕和大麥的混合物飼喂豬，結果表明，磷和鈣的吸收率分別可達到52.56%和78.59%。

1.6 其他 由于大豆蛋白酶抑制因子、凝集素、寡糖、植酸和抗原蛋白等對動物生長性能和生理健康影響較大，因此一直以來對上述幾種大豆抗營養(yǎng)因子的研究較多。其他一些抗營養(yǎng)因子，如脂肪氧化酶、致甲狀腺腫素、皂甙和脲酶等也有報道，但對其研究的深度還有待進一步加強。

2 消除豆粕中抗營養(yǎng)因子的方法

2.1 微生物發(fā)酵法 微生物發(fā)酵法是利用微生物產(chǎn)生的酶來降解豆粕中的抗營養(yǎng)因子，并累積有益的代謝產(chǎn)物。從工藝看，發(fā)酵可以從固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，單菌種發(fā)酵和混合菌種發(fā)酵，以及一步發(fā)酵和多步發(fā)酵三方面分類。發(fā)酵工藝通常要考慮的因素有接種量、氮源、碳源、料水比、發(fā)酵時間、通氣量等。如果選擇合適的菌株，配合適當?shù)陌l(fā)酵條件，可達到降解抗營養(yǎng)因子和大分子蛋白的目的。表1列出了不同菌株和發(fā)酵工藝對豆粕抗營養(yǎng)因子的影響。

表1 發(fā)酵對豆粕抗營養(yǎng)因子的影響

從營養(yǎng)和安全角度來看，發(fā)酵能夠提高大豆食品的抗氧化功能。Rebeca等（2007）分別采用米曲霉、稻根霉菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆48 h，維生素E的含量分別增加31%、30%和89%；總酚（TPC）含量分別增加19%、15%和31.9%。豆粕中異黃酮主要以異黃酮糖苷形式存在，即葡萄糖通過β-葡萄糖苷鍵與異黃酮苷元結合形成異黃酮苷，而只有游離的異黃酮苷元才具有生物學功能。大豆異黃酮苷元還具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性等性質(zhì)。發(fā)酵豆粕異黃酮含量和抗菌性增強，發(fā)酵豆粕中提取、精制的異黃酮對細菌最低抑制濃度（MIC）為0.24%，而豆粕中提取精制的異黃酮對細菌最低抑制濃度為0.48%（楊國峰和周建新，2005）。Kuo等（2006）采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵水解大豆異黃酮糖苷12 h，β-葡萄糖苷酶達到最大值3.3 U/mL，同時大豆苷元從 28.5 μmol/L 上升到 97.4 μmol/L， 染料木苷元從 54.0 μmol/L 上升到 120.3 μmol/L（表 2）。

混合菌種發(fā)酵處理生豆粕也有報道，莫重文和黃岡（2007）用米曲霉（A3.042）和啤酒酵母混合菌株固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵豆粕，利用霉菌生長時分泌的酶系降解豆粕中的多糖和蛋白質(zhì)，使其變成利于消化的低分子糖類、肽類及氨基酸，再通過酵母菌的生長繁殖使這些物質(zhì)變成菌體蛋白，不僅改善適口性，提高消化吸收率，還可提高發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)含量。Lee等（2007）采用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉進行分步發(fā)酵54 h，中性蛋白酶活可達到636 U/g，分別是米曲霉和枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵的1.7倍和2.2倍；氨基酸總含量分別是米曲霉和枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵的3.0倍和18.6倍。

表2 發(fā)酵對豆粕營養(yǎng)成分的影響

2.2 酶制劑處理法 酶解法是通過特定的酶來水解抗營養(yǎng)因子的一種新方法。Caine等（1998）用0.2 mg蛋白酶處理豆粕16 h即可將胰蛋白酶抑制因子的含量從10 mg/g降為0 mg/g；Mulimani等（1997）在豆粕中添加α-糖苷酶在50℃培育4 h，可使豆粕中的棉籽糖和水蘇糖分別下降90.4%和91.9%。賈振寶（2002）采用Alcalase水解豆粕，當水解度達到25%時，β-伴球蛋白被徹底分解。酶解法具有產(chǎn)品安全性高、生產(chǎn)條件溫和、水解易控制、可定位生產(chǎn)特定的大豆肽等優(yōu)點，但其缺點是大豆蛋白質(zhì)利用率不高（Kocher等，2002），僅限于少數(shù)幾種微生物蛋白酶、動物蛋白酶和植物蛋白酶，酶解產(chǎn)肽率較低，且成本高。

2.3 化學處理法 化學鈍化方法是近年來針對胰蛋白酶抑制劑廣泛嘗試的方法，其原理為通過改變TI分子結構，破壞二硫鍵，達到鈍化TI活性的目的。張建云等（1999）用5%尿素+20%水處理生豆餅30 d，使胰蛋白酶抑制因子的失活率達78.55%。另外，通過化學處理在抗原蛋白Gly m Bd 30K上共軛一個多糖可以降低抗原免疫原性，共軛了一個多糖后的Gly m Bd 30K對人過敏血清及Gly m Bd 30K單克隆抗體的反應性完全消失（Arita等，2001）。該處理最可能的原理就是通過共軛反應掩蓋了原有的一些抗原表位，并且共軛多糖后形成的高分子蛋白質(zhì)性物質(zhì)可在一定程度上提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、乳化性和抗菌性。這對于制藥、食品及飼料加工等均有重要的潛在價值?；瘜W鈍化應用的最大阻礙是化學物質(zhì)殘留，處理費用高和大量處理困難 （周春暉和黃惠華，2001）。

2.4 熱處理法 熱處理法對那些熱不穩(wěn)定抗營養(yǎng)因子，如蛋白酶抑制劑、大豆凝血素、致甲狀腺腫素等有較好的抑制效果。Fasina等 （2003）在90～110℃膨化處理大豆20 min，脲酶失活73.9%～99.5%；胰蛋白酶抑制因子含量降為4.86～1.32 mg/g，失活89.6% ～97.2%；凝集素降為0.06～0.00 mg/g，失活95.6% ～100%。但大豆主要抗原蛋白具較高熱穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的加熱處理不能使其有效滅活，因而廣泛存在于大豆制品中（Li等，1991）。熱處理過度還會破壞飼料氨基酸和維生素，導致蛋白質(zhì)消化率下降，降低營養(yǎng)價值。另外，熱處理在破壞大豆抗原蛋白天然分子表面抗原表位的同時，也會暴露出新的抗原表位。熱處理法效率高、簡單易行，無殘留問題，成本也較低，但僅適用于對熱不穩(wěn)定的抗營養(yǎng)因子，且耗能大，控制不當還會破壞豆粕必需營養(yǎng)成分。

2.5 育種法 通過植物育種途徑可培育低或無抗營養(yǎng)因子的植物品種，從根本上去除抗營養(yǎng)因子。韓粉霞等（2005）采用雜交技術和生化分子標記法篩選出無脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑這兩種抗營養(yǎng)因子基因的功能性大豆。但抗營養(yǎng)因子多是植物防御類物質(zhì)（Clarke和Wiseman，2000），降低其含量可能對植物抗病等不利，如增產(chǎn)、抗病能力降低，而且育種周期較長、成功率低，成本也高。并且，在不影響大豆種子結構和生理發(fā)育的情況下，完全去除所有抗原是不可能的。該方法是否會帶來一些營養(yǎng)和功能上的負面影響，或者是否會表達出新的抗原成分也需進一步考證。

綜上所述，微生物發(fā)酵法可有效分解和破壞豆粕中的抗營養(yǎng)因子，提高豆粕的營養(yǎng)價值。與目前普遍采用的物理、化學脫敏方法相比，微生物發(fā)酵技術是一種更為有效、經(jīng)濟的改善豆粕營養(yǎng)價值的手段，更符合健康養(yǎng)殖的要求。

3 小結

植物蛋白質(zhì)原料中普遍存在植物過敏源和抗營養(yǎng)因子，使植物蛋白質(zhì)的消化率和生物學效價遠不及魚粉等動物源性蛋白質(zhì)；同時動物試驗已證實植物過敏物質(zhì)是造成幼齡動物（如斷乳仔豬）腹瀉、生長遲緩等營養(yǎng)性疾病的主要原因。近年來，隨著市場需求增大和相關資源逐步枯竭，優(yōu)質(zhì)動物源性蛋白質(zhì)不斷漲價，已嚴重影響我國養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益。因此去除植物蛋白質(zhì)中抗營養(yǎng)因子，改善植物蛋白質(zhì)品質(zhì)，將其用于替代動物源性蛋白具有現(xiàn)實意義。

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