史汶靈，屈永霞，范小雪，張智慧，黃杉生

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

酶生物傳感器用于環(huán)境中農(nóng)藥殘留的檢測，因其具有高度的選擇性、結(jié)構(gòu)簡單、檢測速度快，成本低，利于在線、可應(yīng)急監(jiān)測而引起人們的越來越多關(guān)注。納米材料制備技術(shù)、生物技術(shù)的發(fā)展為擴(kuò)展生物傳感器的應(yīng)用范圍、提高其靈敏度、微型化打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，極大地促進(jìn)了酶生物傳感器的研究與應(yīng)用[1～3]。

酶生物傳感器用于檢測農(nóng)藥殘留的原理主要有兩種：（1）利用酶的催化放大作用和免疫分析的高特異性，酶催化底物發(fā)生相應(yīng)的水解、氧化或還原反應(yīng)，形成具有電活性的產(chǎn)物，進(jìn)而采用不同的電分析方法進(jìn)行測定[4]；（2）利用農(nóng)藥與酶結(jié)合來抑制酶的活性，農(nóng)藥的濃度與酶被抑制的活性成一定的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藥殘留量的檢測[1]。作為生物傳感器關(guān)鍵組成物-活性酶的固定技術(shù)將直接影響傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度、響應(yīng)時(shí)間和使用壽命等。當(dāng)前國內(nèi)外對酶的固定技術(shù)進(jìn)行了廣泛的研究，并取得了許多重要進(jìn)展[5]。

酶的固定化技術(shù)指的是通過某些方式使酶和載體結(jié)合，使酶被集中或限制，使之在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)。目前酶的固定方法主要有吸附法[6]、共價(jià)鍵結(jié)合法[7]、凝膠/溶膠[8]、交聯(lián)法[9]及自組裝法[10]等方法。

基于帶相反電荷膠體微粒的層層 （lay-bylay）自組裝法，由于其具有成膜的有序性，可在分子水平上控制膜的厚度等優(yōu)點(diǎn)，引起人們廣泛的關(guān)注。層層自組裝法是生物傳感器研究中一個(gè)很重要的生物分子固定化技術(shù)，利用該方法酶分子和媒介體可共同固定到電極表面，易于消除干擾，而且生物傳感信號(hào)可以放大，酶分子仍然具有其活性[5]。

碳納米管被發(fā)現(xiàn)以來，由于其具有很好的電化學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性、良好的導(dǎo)電性、大的比表面積和優(yōu)良的電催化性能，能促進(jìn)電活性物質(zhì)的電子傳遞等優(yōu)點(diǎn)。碳納米管還可作為固定酶的載體材料，使人們對碳納米管在電化學(xué)中的應(yīng)用產(chǎn)生了極大的興趣[11～14]。但采用共價(jià)鍵合法或交聯(lián)法用碳納米管作為固定酶的載體材料時(shí)，需要對碳納米管要用強(qiáng)酸（硫酸和硝酸）進(jìn)行預(yù)處理，并且其與酶交聯(lián)時(shí)間久。在對碳納米管進(jìn)行強(qiáng)酸氧化過程中，也許會(huì)使碳納米管的結(jié)構(gòu)、長短、或者電子特性發(fā)生難以預(yù)料的改變，而且碳納米管難溶于許多溶劑中也給碳納米管-酶傳感器的發(fā)展帶來困擾[15]。

該文描述了一種新的方法來制備酶傳感器。將碳納米管溶解在表面活性劑中，使其表面帶有正/負(fù)電荷。根據(jù)酶的等電點(diǎn)，改變?nèi)芤旱膒H值來使酶帶有相反的電荷，再通過自組裝法，制備出新的酶傳感器。這種方法簡單，不需對碳納米管進(jìn)行酸化。而且酶的活性穩(wěn)定，為制備檢測農(nóng)藥殘留的生物傳感器提供了一種新的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

CHI 600電化學(xué)工作站 (上海辰華儀器有限公司)，采用三電極系統(tǒng)，鉑絲電極作輔助電極，飽和甘汞(SCE)電極為參比電極，銅電極為工作電極；pH計(jì)(6219型，上海任氏電子有限公司)。每次測試前試液均通氮?dú)獬?0 min,實(shí)驗(yàn)中保持氮?dú)夥諊Ｋ须娀瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)均在室溫(25℃)下進(jìn)行。

1.2 試劑及溶液

碳納米管：（MWNTs，φ ＜ 10 nm；長度 0.5～500 μm； 純度 ＞95%，比表面積約為 300 m2/g，深圳市納米港有限公司）。

葡萄糖氧化酶（GOD，上海生工）：10 mg/mL；磷酸緩沖溶液(PBS)：用 0.1 mol/L Na2HPO4和 0.1 mol/L NaH2PO4配制。十六烷基溴化鈉（CTAB,0.85 mg/mL）所有的化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.3 酶-碳納米管-表面活性劑修飾玻碳電極的制備

先將玻碳電極(GC,直徑為4 mm)分別用6號(hào)砂紙、0.3 μm、0.1μm 和 0.05 μm Al2O3拋光粉拋光至鏡面，然后分別在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗各3 min。再分別用2 mol/L NaOH,1∶1 HNO3無水乙醇和水超聲清洗。

GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極的制備：將30 mg/mL的碳納米管分散在30mL的CTAB（1.0%）水溶液中，超聲分散 5 min，制備成黑色的碳納米管懸濁液（1 mg/mL），以4 000 r/min離心30 min，去除少量的比較長的碳納米管，得到上層CTAB-MWNTs溶液。 移取 10 μL的 CTABMWNTs溶液滴加在干凈的GC電極表面，室溫下?lián)]發(fā)至干。再將CTAB-MWNTs-GC浸泡在GOD（10 mg/mL 的 pH7.0 PBS）中 2.5 h，取出，用二次水徹底沖洗干凈，保存在4℃下,pH7.0 PBS溶液中。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶-MWNTs-表面活性劑-GC電極的電化學(xué)性質(zhì)

將MWNTs溶解于CTAB水溶液中，制備MWNTs-CTAB-GC電極，使MWNTs表面帶有正電荷，而 GOD 等電點(diǎn)是 4.2，在 pH7.0 PBS 中荷負(fù)電，再利用LBL的方法制備GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極。

圖1為不同修飾電極在pH7.0的PBS中的循環(huán)伏安曲線。曲線b是MWNTs-CTAB-GC電極，在-0.36 V處有一對很小的肩峰；曲線a是GOD-MWNTs-CTAB-GC電極在相同的掃描電位下，-0.36 V處的肩峰依然存在，說明此峰是CTAB所產(chǎn)生的，另外還出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰，Epa=-0.434 V,Epc=-0.487 V，ΔEp=53 mV，說明此峰是GOD在電極表面發(fā)生直接電化學(xué)所產(chǎn)生的。

2.2 GOD-MWNTs-CTAB-GC電極掃速與峰電流的關(guān)系

圖2是GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極的循環(huán)伏安曲線與掃速的關(guān)系，隨著掃描速度的增加，峰電位差保持一個(gè)常數(shù)，約56 mV，陽極峰電流和陰極峰電流與掃描速度呈線性關(guān)系，說明電極是受電化學(xué)反應(yīng)控制的。

圖1 GOD-MWNTs-CTAB-GC(a),MWNTs-CTAB-GC(b),在0.1 mol/L PBS（pH7.0）中的循環(huán)伏安曲線掃速：100 mV/sFig.1 Cycle voltammograms of different modified electrodes in 0.1mol/L PBS（pH7.0）GOD-MWNTs-CTAB-GC(a),MWNTs-CTAB-GC(b),Scan rates:100 mV/s

2.3 pH的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了GOD-MWNTs-CTAB-GC電極在各種不同pH值的0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的電化學(xué)響應(yīng)(圖3)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)修飾電極的氧化還原峰電位隨著pH的增大而負(fù)移，峰電流隨著pH的增大先增大后減小，在pH7.0的PBS中峰電流較高，氧化還原峰形較好，故實(shí)驗(yàn)選擇pH7.0的PBS溶液。

2.4 MWNTs用量的選擇

實(shí)驗(yàn)考查了GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極的響應(yīng)電流與MWNTs用量的關(guān)系 （圖4）。響應(yīng)電流隨著MWNTs用量的增大而增大，當(dāng)用量超過10 μL時(shí)響應(yīng)電流達(dá)到了一個(gè)平臺(tái)，可能是在不斷增加MWNTs用量的過程中，電極上的活性位點(diǎn)也增加，從而導(dǎo)致響應(yīng)電流也增高；但當(dāng)MWNTs濃度再增大時(shí)，電極表面上的MWNTs膜達(dá)到了飽和，所以響應(yīng)電流不再增加，所以實(shí)驗(yàn)中選擇10 μL的MWNTs-CTAB溶液。

圖2 (a)GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極在0.1 mol/L PBS(pH7.0)中的循環(huán)伏安曲線；(b)氧化峰電流與還原峰電流與掃描速度的關(guān)系。 掃速：20,60,80,100,120 mV/sFig.2 (a)Cycle voltammogram of different scan rate in 0.1 mol/L PBS(pH7.0)；(b)Relation of oxidation and reduction current peaks and scaning rate Scan rate:20,60,80,100,120 mV/s

圖3 GOD-MWNTs-CTAB-GC 在 pH=4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.3 PBS中的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cycle voltammogram of different at GOD-MWNTs-CTAB-GC electrode

圖4 MWNTs用量的影響Fig.4 Effect of concentration of MWNTs

2.5 浸泡時(shí)間的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了MWNTs-CTAB-GC分別浸泡在GOD 中 0.5 h、 1.0 h、2.0 h、2.5 h 和 3.0 h 時(shí)電極的循環(huán)伏安曲線，結(jié)果見圖5。剛開始響應(yīng)電流隨著浸泡在GOD中時(shí)間的增長而明顯增大，當(dāng)浸泡時(shí)間為2.5 h時(shí)，響應(yīng)電流不再增大，故實(shí)驗(yàn)中選擇浸泡時(shí)間為2.5 h。

圖5 浸泡時(shí)間的影響Fig.5 Effect of soaking time

2.6 計(jì)時(shí)安培法檢測H2O2

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極，以安培法來檢測H2O2，結(jié)果見圖6。 H2O2濃度在 1.0×10-6～5.4×10-5mol/L 內(nèi)與響應(yīng)電流呈線性關(guān)系，最低檢測限為5.3×10-7mol/L（3 倍信噪比）。

圖6 GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極檢測H2O2的安培響應(yīng)Fig.6 Determination of H2O2by GOD-MWNTs-CTABGC electrode

2.7 回收率的測定

在一定濃度醫(yī)用消毒水中，以上述電極方法進(jìn)行H2O2含量測定。逐次加入2 μL 0.005 mol/L H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其回收率，結(jié)果列入表1。測定的回收率在95%～104%之間。

表1 樣品的檢測(n=5)Tab.1 The determination results of samples(n=5)

3 結(jié)論

該文基于目前酶傳感器制備技術(shù)基礎(chǔ)上，研究了一種新的酶固定方法。實(shí)驗(yàn)證明，該方法不需對碳納米管進(jìn)行酸化、操作簡單、步驟少、酶固定后電極的穩(wěn)定性高并提高了檢測的響應(yīng)電流，為制備檢測農(nóng)藥殘留的生物傳感器提供了一種新的方法。

[1]羅啟枚，王輝憲，劉登友,等.農(nóng)藥殘留檢測生物傳感器酶固定技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)傳感器，2007,27(3):17～22.

[2]李穎嬌，張榮全，葉非.生物傳感器在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24(8):11～13.

[3]袁永海，李建平.電化學(xué)生物傳感器在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用[J].分析測試學(xué)報(bào)，2006，25(5):121～127.

[4]焦奎，張書圣.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2004，200～203.

[5]董紹俊，車廣禮，謝遠(yuǎn)武.化學(xué)修飾電極[M].科學(xué)出版社，2003，503～509.

[6]陽明輝，李春香，楊云慧,等.基于靜電吸附多層膜固定酶的過氧化氫生物傳感器的研究 [J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2004，62（5）：502～507.

[7]王富科.α-2淀粉酶固定化的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(21):8 872～8 873.

[8]黃超倫,修榮,董秋香,等.凝膠醌氫醌PVC涂膜曲馬多選擇電極的研制[J].分析測試學(xué)報(bào),2005,24(4):35～38.

[9]張璐,張耀東,漆紅蘭.多壁碳納米管修飾酶電極測定馬拉硫磷[J].電化學(xué),2007,13(4):431～435.

[10]溫金鳳,朱愛花,崔勝云.亞硒酸鈉在L-2半胱氨酸自組裝類生物膜修飾電極上的電化學(xué)行為[J].2009,37(12):1 771～1 775.

[11]Liu G D,Lin Y H.Biosensor based on self-assembling acetylcholinesterase on carbon nanotubes for flow injection/amperometric detection of organophosphate pesticides and nerve agents[J].Anal.Chem,2006,78:835 ～843.

[12]Liu G D,Riechers S L,Mellen M C,et al.Sensitive electrochemical detection of enzymatically generated thiocholine atcarbon nanotube modified glassy carbon electrode[J].Electrochemistry Communications,2005,7:1 163～1 169.

[13]Cai C X,Chen J.Direct electron transfer of glucose oxidase promoted by carbon nanotube[J].Electrochemistry,2004,10:159～167.

[14]Davis J J,Coles R J,Hil H A O.Protein electrochemistry at carbon nanotube electrodes[J].J.Electroanal.Chem.,1997,440(1-2);279～282.

[15]Yan X B,Chen X J,Tay B K,et al.Transparent and flexible glucose biosensor via layer-by-layer assembly of multi-wall carbon nanotubes and glucose oxidase[J].Electrochemistry Communications,2007,9:1 269～1 275.