徐 鳳,常艷兵,張銀烽,陶滿(mǎn)蘭,楊云慧

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明650092）

0 引言

納米材料是指材料的基本單元大小限制在1～100 nm范圍的材料。由于其尺寸小而具有的量子效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特性，因此納米材料在催化、磁介質(zhì)、生物醫(yī)藥和生物電分析領(lǐng)域等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[1]。經(jīng)過(guò)近幾十年的研究，已經(jīng)制備出了各種形貌的納米材料，比如納米顆粒[2]、納米管[3]、納米線[4]、納米棒[5]、納米帶[6～7]等。

適體是由25～80個(gè)堿基組成的能與蛋白質(zhì)、多肽、金屬離子、小分子等特異性結(jié)合的寡核苷酸DNA或RNA鏈。自從1990年Gold[8]和Ellington[9]等實(shí)驗(yàn)室各自獨(dú)立地建立自己的核苷酸文庫(kù)并創(chuàng)立一種從超過(guò)1015個(gè)核苷酸分子文庫(kù)里篩選出能與配體專(zhuān)一、高效結(jié)合的DNA或RNA片段的指數(shù)級(jí)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)以后，適體的合成與研究引起了越來(lái)越多的科研工作者的關(guān)注。適體的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)免疫反應(yīng)的不足，也為傳統(tǒng)免疫傳感器注入了新的活力。

由于納米材料在比表面和結(jié)構(gòu)上的重要特性,其研究和開(kāi)發(fā)在近年來(lái)得到迅速發(fā)展,特別在適體生物傳感器的研制方面有廣泛的應(yīng)用。納米材料在適體傳感器中的應(yīng)用主要有兩方面：①將納米材料修飾到電極表面用于適體分子的固定；②納米材料作為標(biāo)記物用于檢測(cè)。該文將從這兩方面來(lái)綜述納米材料最近幾年在適體傳感器中的應(yīng)用。

1 納米材料在適體傳感器中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

1.1 納米材料作為固定材料修飾電極表面

由于納米材料具有比表面積大，電化學(xué)窗口寬，電子傳遞能力高而廣泛應(yīng)用于電極修飾。將納米材料修飾到適體傳感器的表面主要有兩個(gè)方面的作用：提高適體分子的固定量和增大電化學(xué)信號(hào)。

1.1.1 利用金納米顆粒固定適體

隨著生物化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，目前可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)到按要求修飾的合成寡核苷酸，修飾方式主要是在適體DNA的末端連接含硫化合物，再通過(guò)這一基團(tuán)將適體固定在納米金顆粒表面。Chen[10]等研制了一種使用表面增強(qiáng)的拉曼散射光譜來(lái)檢測(cè)腺苷的適體傳感器。先將金包被的銀溶膠固定到金片表面，然后將一段標(biāo)記了巰基的捕獲探針修飾到傳感器表面，再將抗腺苷的適體與標(biāo)記有四甲基羅丹明的DNA的混合物修飾到傳感器上，最后將腺苷滴到傳感器上，由于腺苷與腺苷適體的特異性結(jié)合導(dǎo)致傳感器上標(biāo)記四甲基羅丹明的DNA釋放到拉曼散射的培養(yǎng)基上，這樣就產(chǎn)生了拉曼散射增強(qiáng)的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺苷的檢測(cè)。該傳感器的檢測(cè)線性范圍是2.0×10-8～2.0×10-6mol/L， 檢測(cè)下限為 1.0×10-8mol/L。

Kang等[11]還采用納米金和殼聚糖的混合物修飾電極表面來(lái)改善電極的導(dǎo)電性，開(kāi)發(fā)了一種抗體作為捕獲探針，適體作為檢測(cè)探針，亞甲基藍(lán)作為電活性物質(zhì)的凝血酶電化學(xué)適體傳感器(結(jié)構(gòu)如圖1)。該傳感器的檢測(cè)下限為0.5 nmol/L，檢測(cè)線性范圍為1～60 nmol/L。

Li等[12]將固定到玻碳電極上的金納米顆粒作為固定帶巰基的適體的一個(gè)平臺(tái)，采用[Fe(CN)6]3-/4-作為檢測(cè)探針來(lái)檢測(cè)傳感器界面電子的轉(zhuǎn)移量。凝血酶的量與電極表面電子轉(zhuǎn)移量在凝血酶濃度為0.12～30 nmol/L成線性關(guān)系。該小組考察了三種不同的適體與凝血酶之間的結(jié)合與分解速率，并證實(shí)了將金納米顆粒沉積到玻碳電極作為固定適體的平臺(tái)可以提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。Feng等[13]設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)腺苷的非標(biāo)記型適體傳感器，采用1,6-硫醇將金納米顆粒固定到金電極表面，固定的金納米顆粒能提高電極表面俘獲探針的量，采用亞甲基藍(lán)作為檢測(cè)探針來(lái)檢測(cè)腺苷的量。該傳感器檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，傳感器使用超過(guò)十次后信號(hào)仍能保持到原有信號(hào)的90%。Zhao等[14]設(shè)計(jì)了一種新型的檢測(cè)茶堿的RNA適體傳感器。該小組首先通過(guò)電沉積使玻碳電極表面生成金納米顆粒，然后探針RNA通過(guò)巰基組裝到金納米顆粒上。該小組用阿霉素作為電化學(xué)檢測(cè)探針，通過(guò)阿霉素在電極表面的氧化還原情況檢測(cè)茶堿的濃度，線性范圍為2.0～50.0 μmol/L,檢測(cè)下限為 1.2 μmol/L。Suprun[15]等利用生物素親和素技術(shù)將適體固定到已用金納米顆粒修飾的絲網(wǎng)印刷電極上面，用溶出伏安法在一定電位下將金納米顆粒氧化為金的氧化物，通過(guò)檢測(cè)金的氧化物的量來(lái)測(cè)定電極上凝血酶的含量。該方法的檢測(cè)下限達(dá)10-9mol/L，線性范圍為 10-8～10-5mol/L（溶液中），2×10-14～2×10-11mol/L（電極上）。

圖1 傳感器制備流程圖[11]Fig.1 Schematic representations of the principle for the sensing steps[11]

1.1.2 利用磁性納米顆粒固定適體

Kawde[16]等首次證實(shí)了核酸適體可以用于電化學(xué)檢測(cè)蛋白質(zhì)。該小組首先將生物素標(biāo)記的抗溶菌酶適體結(jié)合到鏈霉親和素化的納米磁珠上，然后再加靶蛋白溶菌酶，由于溶菌酶適體和溶菌酶的特異性結(jié)合導(dǎo)致納米磁珠上溶菌酶適體的解離，用磁性分離從磁珠上解離的溶菌酶適體，最后通過(guò)計(jì)時(shí)電位溶出法檢測(cè)溶菌酶適體的量來(lái)測(cè)定溶菌酶的濃度，該方法對(duì)溶菌酶的檢測(cè)下限為7 nmol/L。

1.1.3 利用碳納米管固定適體

楊佳等[17]用碳納米管負(fù)載釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記的凝血酶適體Ⅱ，根據(jù)釕聯(lián)吡啶衍生物的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的改變采用夾心法檢測(cè)凝血酶的濃度，該方法的檢出限為1.3×10-12mol/L。且在對(duì)凝血酶濃度為1.0×10-10mol/L的情況下進(jìn)行平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%。李延[18]用單壁碳納米管負(fù)載凝血酶的第二段適體和釕聯(lián)吡啶的復(fù)合物構(gòu)成電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針檢測(cè)凝血酶， 該傳感器檢測(cè)的線性范圍為 1.0×10-14～1.0×10-11mol/L，檢測(cè)下限為 3.0×10-15mol/L，且在凝血酶的濃度為5.0×10-13mol/L的情況下進(jìn)行11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%。

1.2 納米材料作為標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)

1.2.1 以金納米顆粒為標(biāo)記物

Wang等[19]設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)發(fā)光適體傳感器來(lái)檢測(cè)腺苷的濃度。該組將金納米顆粒與電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)釕聯(lián)吡啶形成的絡(luò)合物標(biāo)記作為傳感器的發(fā)光平臺(tái)，將二茂鐵標(biāo)記的腺苷適體作為發(fā)光強(qiáng)度控制開(kāi)關(guān)，通過(guò)傳感器的發(fā)光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)腺苷的濃度。鄭靜等[20]將凝血酶的第二段適體用金膠標(biāo)記后作為檢測(cè)信標(biāo)，采用夾心法通過(guò)檢測(cè)信標(biāo)金膠上的核苷酸鏈與另一段標(biāo)記有金膠的互補(bǔ)鏈進(jìn)一步雜交而實(shí)現(xiàn)金的選擇性富集，金的富集可實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增而大大提高了傳感器的靈敏度。該傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2，此方法對(duì)凝血酶的檢測(cè)下限達(dá)4.52×10-15mol/L，且在對(duì)凝血酶濃度為7.47×10-14mol/L的情況下平行測(cè)定8次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%。

圖2 凝血酶適體生物傳感器示意圖[20]Fig.2 Schematic illustration of the thrombin aptasensor[20](A)Fabrication of the sandwich format bymagnetic nanoparticle labeled aptamerⅠ,thrombin and gold nanoparticle labeled aptamerⅡ;(B)enrichment of gold nanoparticles through the hybridization with the complementary oligonucleotide

Wang等[21]利用凝血酶為模型設(shè)計(jì)了一種利用金納米顆粒和適體組合的適體傳感器，原理是將用染料標(biāo)記的DNA和標(biāo)記有金納米顆粒的適體雜交，利用金納米顆粒的熒光淬滅程度實(shí)現(xiàn)凝血酶的檢測(cè)，該組設(shè)計(jì)了三種模型并認(rèn)為通過(guò)自組裝將適體和金納米顆粒固定到電極上是最好的模型。Wang等[22]將納米顆粒和適體相結(jié)合采用表面等離子共振的方法靈敏的檢測(cè)了人類(lèi)免疫球蛋白E(IgE)。該傳感器利用了金納米顆粒對(duì)檢測(cè)信號(hào)的放大作用，檢測(cè)下限為1 ng/mL。Zheng等[23]同時(shí)利用了磁性納米顆粒和金納米顆粒開(kāi)發(fā)了一種快速高效靈敏檢測(cè)凝血酶的適體傳感器。該文用磁性納米顆粒固定適體，用金納米顆粒標(biāo)記互補(bǔ)核苷酸鏈，將適體與互補(bǔ)核苷酸的雜交體系作為探針，由于凝血酶的引入，導(dǎo)致探針結(jié)構(gòu)破壞，標(biāo)記金納米顆粒的互補(bǔ)核苷酸被釋放出來(lái)，再將游離出來(lái)的金納米顆粒氧化為AuCl4-，最后用差分脈沖法檢測(cè)AuCl4-的信號(hào)來(lái)檢測(cè)凝血酶的濃度。該方法的優(yōu)越性在于能簡(jiǎn)單快速而靈敏的檢測(cè)凝血酶并由于不需要標(biāo)記凝血酶而可以用于復(fù)雜體系真實(shí)樣品的檢測(cè)。

1.2.2 以量子點(diǎn)為標(biāo)記物

Yang等[24]利用CdSe量子點(diǎn)標(biāo)記凝血酶第二段適體，采用夾心法依次將凝血酶的第一段適體、凝血酶、標(biāo)記量子點(diǎn)的第二段適體固定到金電極表面，然后通過(guò)在硝酸溶液中用方波溶出伏安法來(lái)檢測(cè)Cd2+的濃度來(lái)測(cè)定凝血酶的濃度，且該傳感器在凝血酶濃度為1 pmol/L時(shí)平行測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.3%。 Huang[25]等設(shè)計(jì)了一種采用量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)凝血酶的適體傳感器。首先將巰基標(biāo)記的凝血酶第一段適體固定到金電極上，然后將目標(biāo)物凝血酶結(jié)合到適體1上，接著向電極上滴加用生物素標(biāo)記的凝血酶適體2，這樣電極上就形成了適體1/凝血酶/適體2的夾心結(jié)構(gòu)。最后將鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)被加到電極上與適體2形成生物素-親和素體系，量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)弱反應(yīng)了電極上凝血酶的濃度，該傳感器檢測(cè)的線性范圍為0～20 μg/mL,且該傳感器選擇性好，性能穩(wěn)定。

2 展望

納米材料是一種性能優(yōu)異的功能材料，應(yīng)用開(kāi)發(fā)的前景十分廣闊。將納米材料應(yīng)用于適體傳感器為適體傳感器的發(fā)展提供了巨大的空間。與傳統(tǒng)的傳感器相比，基于納米材料的適體傳感器具有超高的靈敏度和良好的選擇性，且可實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)時(shí)檢測(cè)分析。但是由于一些納米材料合成困難以及適體的篩選耗時(shí)，篩選過(guò)程復(fù)雜等不利因素制約了基于納米材料的適體傳感器的發(fā)展。隨著納米技術(shù)和傳感器技術(shù)的發(fā)展，如何將納米科學(xué)和適體傳感器有機(jī)的結(jié)合，如何利用納米材料的特殊性能來(lái)提高適體傳感器的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)通量是科研工作者努力的方向和研究的熱點(diǎn)，也是適體傳感器發(fā)展的新方向之一。

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