方正輝，靳 珍，萬其中*，張曉兵

(1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南岳陽414000)（2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)/生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙410082）

0 引言

熒光分析法具有較高的靈敏度，一般比分光光度法高2～3個數(shù)量級，且具有選擇性高，方法簡便，取樣量少等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到迅速發(fā)展?？捎糜跍y定的無機(jī)物、有機(jī)物、生物物質(zhì)和藥物等數(shù)目劇增，使熒光分析越來越成為分析工作者必須掌握的一種重要的分析手段[1]。

卟啉化合物廣泛存在于自然界的生命體中，如血紅蛋白、肌紅蛋白、葉綠素、維生素B12、細(xì)胞色素P-450等物質(zhì)都具有卟啉骨架結(jié)構(gòu)。卟啉(Porphyrin)是卟吩(Porphine)外環(huán)帶有取代基的同系物和衍生物的總稱。卟吩是由4個吡咯環(huán)和4個次甲基橋聯(lián)起來的18π電子的大環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，具有平面分子結(jié)構(gòu)和芳香性，不同的卟吩分子其平面性不同，共軛程度也不同。其結(jié)構(gòu)見圖1中的化合物1。從圖中可以看出，其結(jié)構(gòu)具有以下幾個特點(diǎn)：1）卟吩分子中4個吡咯環(huán)的8個β位和4個中位(meso-)的氫原子均可被其它基團(tuán)所取代，生成各種各樣的卟吩衍生物，即卟啉[2]。2）當(dāng)卟吩環(huán)中的兩個吡咯上的氫原子被金屬離子取代時，形成金屬卟啉，現(xiàn)在卟啉幾乎與所有的金屬離子都能形成配合物，因此，配合物的種類繁多。3）卟啉是兩性化合物，其中兩個吡咯環(huán)上的氮原子可接受質(zhì)子，又可以給出質(zhì)子。4）卟吩的骨架是非常容易變形的，其分子構(gòu)型與四個中位(meso-)的取代基有關(guān)。卟吩由于沒有取代基而近于平面結(jié)構(gòu)，而四取代的卟啉，與其分子平面呈現(xiàn)出不同程度的偏離，如四苯基卟啉（化合物2）。卟啉若與較大的金屬離子形成配合物后，則本來為平面的大環(huán)將會發(fā)生扭曲。由于卟啉化合物具有上述的光物理特性，它的激發(fā)和發(fā)射波長均在可見光區(qū)，具有較高的摩爾吸光系數(shù)，其分子結(jié)構(gòu)易于修飾，且具有較大的Stokes位移，這有利于減少熒光背景的影響[3～4]，而且金屬卟啉又表現(xiàn)出不同于卟啉的熒光性質(zhì)，因此，卟啉類化合物已在熒光傳感領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5]。

圖1 卟啉的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of porphyrin

1 卟啉探針用于生物分子的檢測

卟啉是生物體內(nèi)血紅蛋白、細(xì)胞色素和酶的輔基，具有特殊的生物活性，因此能與氨基酸、核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用。已有報(bào)道卟啉已成功用于部分DNA、RNA、蛋白質(zhì)和氨基酸的檢測。1996年，Takahata小組[6]利用有些生物分子能把沒有熒光的金屬卟啉中的金屬離子拉出來而發(fā)出卟啉熒光現(xiàn)象檢測L-半胱氨酸和谷胱甘肽。在這個基礎(chǔ)上，Yang等[7]利用一個組氨酸可以絡(luò)合兩個鋅卟啉的性質(zhì)，巧妙設(shè)計(jì)了一個鋅卟啉-芘復(fù)合物。利用加入組氨酸前后，分別表現(xiàn)為芘的單體和二聚體熒光性質(zhì)的不同實(shí)現(xiàn)了組氨酸的檢測。鈀卟啉在除氧條件下能嵌插到雙鏈DNA的GC富集區(qū)后，室溫下磷光增強(qiáng)，與時間分辨技術(shù)聯(lián)用，可作為DNA檢測探針[8]。Gurrieri小組[9]在1999年成功地研制出了檢測DNA分子的新方法，他們把水溶性的四磺酸基卟啉陰離子通過靜電作用與帶正電的聚賴氨酸組裝成超分子體系，在組裝的過程中，卟啉的熒光大大猝滅，而當(dāng)有DNA存在時，帶負(fù)電的DNA分子把卟啉置換出來，使體系熒光恢復(fù)。光譜法研究四氨基苯基卟啉和四甲基吡啶基卟啉與核酸的作用表明，卟啉與核酸摩爾比(R)大于0.25時，由于超螺旋結(jié)構(gòu)的形成，核酸對卟啉的Soret帶有減色效應(yīng)、對熒光有熄滅效應(yīng)，并增強(qiáng)四氨基苯基卟啉的共振光散射信號，但對四甲基吡啶基卟啉的共振光散射無影響；而當(dāng)R小于0.25時，則生成新的熒光復(fù)合物[10]，利用此作用，可測定DNA和RNA。2008年，楊榮華等[11]利用鈷卟啉能夠與自由基卟啉形成基態(tài)復(fù)合物而能夠猝滅其熒光而加入能夠與鈷卟啉強(qiáng)相互作用的蛋白質(zhì)又能破壞這種復(fù)合物的原理，成功用于牛血清蛋白和人血清蛋白的檢測。

2 卟啉探針用于氣體小分子的檢測

卟啉自由堿具有很強(qiáng)的熒光，而金屬卟啉的熒光卻相對較弱，但恰恰由于金屬的引入，使很多含氮、氧、硫等氣體小分子能從卟啉平面的上下兩個方向與卟啉環(huán)中的金屬形成絡(luò)合物，減弱金屬與卟啉的相互作用，從而使卟啉的熒光逐漸恢復(fù)，因此可以利用卟啉熒光恢復(fù)來檢測氣體小分子。目前已有報(bào)道卟啉熒光探針可用于氧氣、氯化氫、二氧化碳、一氧化氮、二氧化氮、氨氣等氣體的檢測。2001年，Richardson等[12]利用溶膠-凝膠技術(shù)包裹四取代卟啉化合物成功實(shí)現(xiàn)了對NO2的檢測，與多層LB膜固定方法相比，該方法靈敏度增強(qiáng)了1 400%。楊榮華等[13]報(bào)道了全-(2,6-二-O-異丁基)β-環(huán)糊精對固定于PVC膜中的meso-四(4-甲氧基苯基)卟啉(TMOPP)有明顯的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，且該熒光可被溶液中的CO2可逆猝滅。TMOPP受紫外光照激發(fā)后能發(fā)出紫色熒光，但與水溶液中CO2作用后形成不發(fā)熒光的配合物。在pH為9.0條件下與空白溶液和CO2水溶液接觸后的發(fā)射熒光光譜(423 nm激發(fā))顯示，隨著CO2溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，敏感膜的熒光強(qiáng)度逐漸減小，可用于CO2含量的測定。Amao[14]小組把四(五氟苯基)鉑卟啉固定到聚三氟乙基甲基丙烯酸酯膜中來測氧，該探針不僅響應(yīng)快速，且穩(wěn)定耐用。環(huán)境要求空氣中氯化氫氣體的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)在5×10-6以下，因此，對熒光探針檢測限要求較高，目前，檢測空氣中氯化氫的熒光探針已經(jīng)取得較大進(jìn)展。主要采用烷氧基四苯基卟啉和羥基四苯基卟啉作為檢測氯化氫的熒光探針。質(zhì)子化卟啉的熒光性質(zhì)與自由堿卟啉差別很大，利用這個現(xiàn)象，發(fā)展了基于卟啉的氯化氫氣體熒光探針，1995年Nakagawa[15]把卟啉固定到親酯性的硅樹酯中，制成了對氯化氫氣體響應(yīng)的熒光探針。Baron[16]和Smith[17]也做過類似的工作，成功地檢測了大氣中氯化氫氣體的含量。

3 卟啉探針用于陽離子的檢測

熒光法在靈敏度、選擇性、檢測下限、以及響應(yīng)時間等方面都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于光度法，而且不同金屬離子對不同自由堿卟啉的熒光猝滅程度相差較大，因此，基于卟啉的金屬陽離子熒光探針得到了廣泛的研究。1964年，F(xiàn)ack[18]根據(jù)金屬卟啉絡(luò)合物在Soret帶附近摩爾吸光系數(shù)可達(dá)3×105～5×105，預(yù)言了卟啉類化合物作為金屬高靈敏試劑的應(yīng)用前景。其后又有幾個小組報(bào)道了用不同卟啉衍生物在不同條件下光度法測定Cu2+，Pb2+，Cd2+等[19]。即使在熒光法的應(yīng)用較光度法廣泛的今天，仍不時有一些基于卟啉分光光度法測金屬離子的報(bào)導(dǎo)出現(xiàn)。

卟啉可以與金屬陽離子配位形成金屬卟啉。而且金屬卟啉與自由堿卟啉的吸收光譜和發(fā)射光譜又完全不一樣，因此，利用不同的卟啉化合物就能直接測定金屬離子。翁彥琴等[20～21]分別設(shè)計(jì)了對稱的四（4-二(2-吡啶基)氨基苯基）-鋅卟啉和 5-（4-二(2-吡啶基)氨基苯基）），5，10，15-三（4-甲氧基苯基）鋅卟啉。由于高濃度卟啉與金屬卟啉能夠自猝滅和二(2-吡啶基)氨基與Cu2+2∶1絡(luò)合的特性，銅離子的加入使得熒光探針分子團(tuán)聚形成網(wǎng)狀或線狀聚合物，鋅卟啉熒光猝滅。張曉兵等[22]設(shè)計(jì)合成了一個新的卟啉二聚物，并首次將其用作測定Hg2+的光化學(xué)傳感器的熒光載體，這種卟啉二聚體由于具有兩個卟啉環(huán)而相對于單卟啉來說對汞離子有更好的熒光響應(yīng)特性。該傳感器對汞離子在較寬的線性范圍內(nèi)有響應(yīng)，在較寬的pH范圍內(nèi)幾乎不受pH的影響，在堿金屬離子、堿土金屬離子、及常見過渡金屬離子存在下對汞離子有非常好的選擇性。

文獻(xiàn)中已有不少報(bào)道利用卟啉的金屬化來檢測金屬離子，但是與開鏈配體相比，卟啉環(huán)的金屬化過程比較慢。基于此，張曉兵等利用卟啉僅作為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了含有2-（氧甲基）吡啶的化合物，用作鋅離子熒光探針的研究。該探針在無催化劑條件下，通過熒光比率法實(shí)現(xiàn)對鋅離子的檢測[23]。熒光比率法是通過比較兩個熒光發(fā)射峰的比率來實(shí)現(xiàn)對金屬離子的檢測的，這樣有利于增加響應(yīng)范圍，減少環(huán)境因素的影響。2009年，張曉兵等[24]又設(shè)計(jì)合成了一個卟啉-萘酰亞胺雜交體的比率性熒光探針用于水相中Hg2+的檢測及活細(xì)胞中Hg2+的熒光成像研究。探針的兩個熒光基團(tuán)具有相同的激發(fā)波長范圍（410～420 nm），不同的發(fā)射波長，且兩個熒光發(fā)射峰之間的位移較寬（125 nm），有效的避免了基于波譜移動的比率型探針常具有的發(fā)射峰波譜重疊的缺陷，特別適合用于生物樣品（如細(xì)胞）中Hg2+比率型熒光成像研究。

時至今日，已有報(bào)道卟啉可以用于Zn2+、Cd2+、Li+、Cu2+、Na+、Co2+、Pd2+、Hg2+以及 H+的檢測等。在熒光分析法越來越成熟的今天，人們研制出對更多金屬陽離子有更高選擇性和更低檢測下限的熒光探針，并將其制作成簡易傳感器，用于實(shí)際樣品檢測分析。如今，人們多將這些熒光探針用于細(xì)胞中某種金屬陽離子的檢測，進(jìn)一步與生物結(jié)合，逐漸實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)檢測的現(xiàn)實(shí)意義。

4 卟啉探針用于陰離子的檢測

金屬卟啉中心絡(luò)合的金屬離子往往還能與陰離子形成絡(luò)合物而使其自身的光學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，基于這個原理分析工作者發(fā)展了很多測陰離子的探針，但是這些探針多是基于光吸收信號變化的[25～28]。卟啉環(huán)上含有豐富的氮原子，稍加修飾（如氮原子質(zhì)子化）就可以對某些陰離子產(chǎn)生識別。1992年，Shionoya[29]設(shè)計(jì)合成了一種新型卟啉衍生物，他們用該衍生物作為熒光分子探針對F-進(jìn)行檢測，得到令人滿意的結(jié)果。該文章通過設(shè)計(jì)合成一種與陰離子有強(qiáng)結(jié)合作用的卟啉衍生物，為卟啉在陰離子熒光探針方面的發(fā)展進(jìn)行探索，為卟啉研究提出了一個新的方向。Zhang等[30]通過把四苯基卟啉質(zhì)子化(H4TPP2+)就制成了對Cl-響應(yīng)的熒光探針。Cl-的加入使651 nm的熒光強(qiáng)度降低，而使683 nm的熒光強(qiáng)度升高，通過擬合曲線，H4TPP2+與Cl-形成了1∶2的絡(luò)合物。擴(kuò)展卟啉有更大的空間和更多的有機(jī)胺基團(tuán)，不需要質(zhì)子化就可以直接對陰離子進(jìn)行識別，在這個方面研究較多[31～32]，大部分還是基于光吸收信號變化。

5 卟啉探針用于中性物質(zhì)的檢測

四苯基卟啉由于自身不帶特殊基團(tuán)，因而與一些中性物質(zhì)的作用較弱，所以直接用它來單獨(dú)檢測中性化合物是不現(xiàn)實(shí)的，但如果讓它與一些大分子作用形成超分子體系，改變檢測環(huán)境，增強(qiáng)卟啉對中性物質(zhì)的熒光檢測信號，從而實(shí)現(xiàn)卟啉化合物對一些中性分子的檢測。2000年，楊榮華等[33]基于蒽與H2TPP之間的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，制備出高靈敏的單質(zhì)碘熒光分子探針，該熒光探針比傳統(tǒng)熒光探針的靈敏度提高近一倍。同年，他們[34]還研究了烷基化β-環(huán)糊精與H2TPP的包絡(luò)作用，并研制了基于熒光增強(qiáng)的脂肪胺光化學(xué)熒光探針。后來他們[35]又以H2TPP為熒光載體研制了基于熒光增強(qiáng)的Tween-60光化學(xué)熒光探針，除Tween-80外，其它表面活性劑及離子對測量無干擾。2006年，李廣濤教授小組[36]用小分子或大分子表面活性劑把一系列卟啉或金屬卟啉成功摻雜到硅薄膜中并用于檢測TNT、DNT等爆炸物的微量蒸汽。2007年，該組又利用溶膠凝膠化學(xué)和簡單、低廉的電紡絲技術(shù)將卟啉摻雜納米復(fù)合物制成了大比表面積、良好氣體滲透性的熒光納米纖維膜并實(shí)現(xiàn)了對微量爆炸物蒸汽的低濃度檢測[37]。

6 結(jié)束語

綜上所述，可以看出，卟啉化合物已在生物分子、氣體小分子、陽離子、陰離子以及中性物質(zhì)熒光探針方面得到很大發(fā)展。卟啉類化合物在熒光分析中的應(yīng)用正處于快速的發(fā)展之中，前景喜人。當(dāng)然，也還有不少工作有待今后研究，探索對更廣泛的樣品進(jìn)行測定的可能性，研究其作為重金屬離子、DNA熒光探針在臨床分析中的實(shí)際應(yīng)用等。可以期望，隨著卟啉類衍生物的不斷出現(xiàn)，其在熒光分析中的應(yīng)用將會得到進(jìn)一步的發(fā)展。

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