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        奧曲肽抑制人卵巢癌細胞增殖的研究

        2010-06-22 01:03:52李煒虹沈楊張云霞任慕蘭
        關(guān)鍵詞:卵巢癌空白對照切片

        李煒虹,沈楊,張云霞,任慕蘭

        (1.南京市市級機關(guān)醫(yī)院 婦科,江蘇 南京 210008;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇 南京 210009)

        生長抑素(somatostatin,SST)是一種環(huán)狀多肽類激素,由Brazeau等[1]于1973年從羊下丘腦中分離提取?,F(xiàn)在認為SST對許多疾病如腫瘤、炎癥、糖尿病、癲癇、早老性癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈病以及艾滋病的發(fā)生、發(fā)展和防治具有重要意義[2]。奧曲肽(SMS-201995,OCT)為SST 8肽類似物,是第一個用于臨床的SST類似物,目前其主要用于肝癌、胃癌和胰腺癌的輔助治療。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        基礎(chǔ)培養(yǎng)液:RPMI 1640培養(yǎng)液,加入10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶(上海華美公司):溶于D-Hanks液中配制成0.25%濃度;SST類似物OCT:由上海子能制藥有限公司合成;順鉑(cisplatin):山東齊魯制藥廠產(chǎn)品,4℃保存;人卵巢癌細胞株SKOV3:購自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室,細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化細胞成單細胞懸液;雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠:購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所,體重18~22 g,SPF環(huán)境下飼養(yǎng);兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體:購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立 將SKOV3細胞制成單細胞懸液,以5×106個細胞·只-1接種于裸鼠右側(cè)腋窩靠近背部皮下,共接種20只。

        1.2.2 藥物干預(yù)移植瘤 建模2周后將20只裸鼠隨機分成空白對照組、OCT組、順鉑組、OCT與順鉑聯(lián)用組4組,每組5只??瞻讓φ战M皮下注射生理鹽水100 μg·kg-1,1 次·d-1;OCT 組皮下注射 OCT 100 μg·kg-1,1 次·d-1;順鉑組分別于成瘤后第 1、8、15、22 日腹腔注射順鉑4 mg·kg-1;OCT與順鉑聯(lián)用組皮下注射 OCT 100 μg·kg-1,1 次·d-1,并于成瘤后第1、8、15、22日腹腔注射順鉑4 mg·kg-1。用藥4周后頸椎脫位法處死裸鼠,皮下剝離瘤體,稱取腫瘤重量,游標卡尺測量腫瘤長徑(a)和短徑(b),按公式V=ab2/2計算腫瘤體積。抑瘤率=(對照組瘤體積-實驗組瘤體積)/對照組瘤體積×100%。腫瘤標本分為兩份,1份置于10%中性緩沖福爾馬林液中固定,常規(guī)脫水,透明,浸蠟,包埋,5 μm連續(xù)切片;另1份立即制成單細胞懸液行流式細胞分析。

        1.2.3 病理學(xué)分析及免疫組織化學(xué)法檢測VEGF表達 腫瘤切片行常規(guī)蘇木精-伊紅染色,顯微鏡下觀察腫瘤細胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)染色采用兩步法,結(jié)果判定以細胞漿呈清晰棕黃色為陽性,采用計算機圖像分析軟件Image-Pro plus 4.5對VEGF陽性部位進行原位定量檢測,每張切片隨機選取5個視野,自動選取陽性部位并計算平均光密度(IOD)值,計算5個視野的平均值作為該切片的代表值。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

        結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件,多組間比較采用方差分析,兩兩之間用q檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 OCT對裸鼠卵巢癌移植瘤生長的影響

        20只裸鼠接種7 d后于接種部位皮下均可見直徑約2 mm的瘤塊,致瘤率為100%,用藥滿28 d時20只裸鼠均存活。處死裸鼠見腫瘤處皮膚表面無潰瘍結(jié)痂,腫瘤包膜完整,均可用手推動。OCT組、順鉑組、OCT與順鉑聯(lián)用組腫瘤重量及體積均明顯低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各用藥組兩兩比較,腫瘤重量及體積無顯著性差異。見表1。

        表1 各用藥組移植瘤重量及體積的變化Tab 1 Changes of tumor weight and volume in treated mice

        2.2 病理學(xué)分析及免疫組織化學(xué)法檢測VEGF表達

        腫瘤組織蘇木精-伊紅染色切片見腫瘤細胞大小不一,胞漿粉紅色,核圓形,腫瘤內(nèi)可見血管結(jié)構(gòu)。VEGF染色主要定位于腫瘤細胞胞漿,呈棕黃色,少數(shù)血管內(nèi)皮細胞也見有陽性表達。各用藥組移植瘤組織中VEGF表達明顯下降,與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),但各用藥組兩兩間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.267)。見圖1。

        圖1 免疫組織化學(xué)法檢測各實驗組腫瘤組織VEGF的表達Fig 1 VEGF expressions on tumor was examined by immunohistochemistry

        3 討 論

        SST廣泛分布于大多數(shù)人體器官組織,具有抑制激素分泌、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞及細胞增殖的作用。已有研究證實卵巢癌中存在生長抑素受體(SSTR)的表達,如陳懷增等[3]采用RT-PCR方法證實卵巢癌細胞株SKOV3及3AO均表達Ⅱ型 SSTR(SSTR2)。Hall等[4]利用免疫組織化學(xué)方法對63例惡性卵巢腫瘤和35例良性卵巢腫瘤患者的SSTR表達進行了檢測,發(fā)現(xiàn)SSTR在腫瘤組織上皮、間質(zhì)以及血管中均有不同程度的表達,在卵巢腫瘤組織血管壁的中膜平滑肌中亦可見SSTR的高表達。這些實驗提供了SST治療卵巢癌的可能性。

        本實驗結(jié)果顯示在給予OCT、順鉑及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后,移植瘤重量及體積均明顯低于空白對照組,但各用藥組兩兩間比較抑瘤作用無顯著性差異,提示對于卵巢癌,非化療藥OCT可能具有相當于順鉑的抗腫瘤效果。順鉑是目前臨床治療卵巢癌患者的一線化療藥物,但其毒副反應(yīng)較大且易產(chǎn)生耐藥,而肽類化合物OCT副反應(yīng)小,可望用于對順鉑耐藥的卵巢癌患者。

        腫瘤的血管生成是由腫瘤細胞分泌的各種促血管生成因子所誘發(fā),其中VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的血管生成因子。它具有增加血管通透性、促進不同來源的內(nèi)皮細胞分裂增殖和血管構(gòu)建及促使內(nèi)皮細胞遷移等多種作用,以VEGF作為抗腫瘤血管生成治療的理想靶點已逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的共識。Osada等[5]的研究表明,VEGF高表達的卵巢癌患者生存率明顯低于VEGF低表達者。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色法檢測腫瘤組織內(nèi)VEGF的表達,結(jié)果顯示各用藥組VEGF的表達較空白對照組明顯下降,提示OCT抗腫瘤作用機制之一為抑制腫瘤新生血管生成。

        據(jù)文獻[6-10]報道SST及SSTA抗腫瘤作用的機制可能包括:(1)通過與SSTR結(jié)合直接抑制腫瘤細胞增殖;(2)抑制促腫瘤生長的激素或細胞因子的釋放;(3)抑制腫瘤血管生成;(4)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

        本實驗證實OCT對卵巢癌細胞株的抑制作用與傳統(tǒng)抗腫瘤藥順鉑相當,可為卵巢癌治療提供新途徑。

        [1]BRAZEAU P,VALE W,BURGUS R.Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone[J].Science,1973,179(68):77-79.

        [2]GUILLERMET-GUIBERT J,LAHLOU H,GORDELIER P,et al.Physiology of somatostatin receptors[J].J Endocrinol Invest,2005,28(11 Suppl):5-9.

        [3]陳懷增,謝幸,葉大風(fēng),等.卵巢上皮性癌生長抑素受體2表達的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002,37(5):306-307.

        [4]HALL G H,TURNBULL L W,RICHMOND I,et al.Localization of somatostatin and somatostatin receptors in bening and malignant ovarian tumors[J].Br Cancer,2002,87(1):86-90.

        [5]OSADA R,HORIUCHI A,KIKUCHI N,et al.Expression of semaphorins,vascular endothelial growth factor,and their common receptor neuropilins and alleic loss of semaphorin locus in epithelial ovarian neoplasms:increased ratio of vascular endothelial growth factor to semaphorin is a poor prognostic factor in ovarian carcinomas[J].Hum Pathol,2006,37(11):1414-1425.

        [6]HE Y,YUAN X M,LEI P,et al.The antiproliferative effects of somatostatin receptor subtype 2 in breast cancer cells[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(7):1053-1059.

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        [8]SONGGANG L,JIYU L,GONGWE I,et al.Somatostatin enhances the chemosensitivity of GBC-SD cell line to doxorubicin through arresting the cell cycle to S phase rather than through the P53/Bax-depended apoptosis way in vitro[J].Hepatogastroenterology,2009,56(94-95):1253-1260.

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        [10]GABRIEL M,ANDERGASSEN U,PUTZER D,et al.Individualized peptide-related-radionuclide-therapy concept using different radiolabelled somatostatin analogs in advanced cancer patients[J].Q J Nucl Med Mol Imaging,2010,54(1):92-99.

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