李煒虹，沈楊，張?jiān)葡?，任慕蘭

(1.南京市市級機(jī)關(guān)醫(yī)院 婦科，江蘇 南京 210008;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

生長抑素(somatostatin，SST)是一種環(huán)狀多肽類激素，由Brazeau等［1］于1973年從羊下丘腦中分離提取?，F(xiàn)在認(rèn)為SST對許多疾病如腫瘤、炎癥、糖尿病、癲癇、早老性癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈病以及艾滋病的發(fā)生、發(fā)展和防治具有重要意義［2］。奧曲肽(SMS-201995，OCT)為SST 8肽類似物，是第一個(gè)用于臨床的SST類似物，目前其主要用于肝癌、胃癌和胰腺癌的輔助治療。

1 材料和方法

1.1 材料

基礎(chǔ)培養(yǎng)液:RPMI 1640培養(yǎng)液，加入10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶(上海華美公司):溶于D-Hanks液中配制成0.25%濃度;SST類似物OCT:由上海子能制藥有限公司合成;順鉑(cisplatin):山東齊魯制藥廠產(chǎn)品，4℃保存;人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3:購自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液;雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠:購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，體重18～22 g，SPF環(huán)境下飼養(yǎng);兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體:購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立 將SKOV3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以5×106個(gè)細(xì)胞·只－1接種于裸鼠右側(cè)腋窩靠近背部皮下，共接種20只。

1.2.2 藥物干預(yù)移植瘤 建模2周后將20只裸鼠隨機(jī)分成空白對照組、OCT組、順鉑組、OCT與順鉑聯(lián)用組4組，每組5只?？瞻讓φ战M皮下注射生理鹽水100 μg·kg－1，1 次·d－1;OCT 組皮下注射 OCT 100 μg·kg－1，1 次·d－1;順鉑組分別于成瘤后第 1、8、15、22 日腹腔注射順鉑4 mg·kg－1;OCT與順鉑聯(lián)用組皮下注射 OCT 100 μg·kg－1，1 次·d－1，并于成瘤后第1、8、15、22日腹腔注射順鉑4 mg·kg－1。用藥4周后頸椎脫位法處死裸鼠，皮下剝離瘤體，稱取腫瘤重量，游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積。抑瘤率=(對照組瘤體積－實(shí)驗(yàn)組瘤體積)/對照組瘤體積×100%。腫瘤標(biāo)本分為兩份，1份置于10%中性緩沖福爾馬林液中固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，5 μm連續(xù)切片;另1份立即制成單細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞分析。

1.2.3 病理學(xué)分析及免疫組織化學(xué)法檢測VEGF表達(dá) 腫瘤切片行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)染色采用兩步法，結(jié)果判定以細(xì)胞漿呈清晰棕黃色為陽性，采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image-Pro plus 4.5對VEGF陽性部位進(jìn)行原位定量檢測，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，自動(dòng)選取陽性部位并計(jì)算平均光密度(IOD)值，計(jì)算5個(gè)視野的平均值作為該切片的代表值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較采用方差分析，兩兩之間用q檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OCT對裸鼠卵巢癌移植瘤生長的影響

20只裸鼠接種7 d后于接種部位皮下均可見直徑約2 mm的瘤塊，致瘤率為100%，用藥滿28 d時(shí)20只裸鼠均存活。處死裸鼠見腫瘤處皮膚表面無潰瘍結(jié)痂，腫瘤包膜完整，均可用手推動(dòng)。OCT組、順鉑組、OCT與順鉑聯(lián)用組腫瘤重量及體積均明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各用藥組兩兩比較，腫瘤重量及體積無顯著性差異。見表1。

表1 各用藥組移植瘤重量及體積的變化Tab 1 Changes of tumor weight and volume in treated mice

2.2 病理學(xué)分析及免疫組織化學(xué)法檢測VEGF表達(dá)

腫瘤組織蘇木精-伊紅染色切片見腫瘤細(xì)胞大小不一，胞漿粉紅色，核圓形，腫瘤內(nèi)可見血管結(jié)構(gòu)。VEGF染色主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿，呈棕黃色，少數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞也見有陽性表達(dá)。各用藥組移植瘤組織中VEGF表達(dá)明顯下降，與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，但各用藥組兩兩間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.267)。見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織VEGF的表達(dá)Fig 1 VEGF expressions on tumor was examined by immunohistochemistry

3 討 論

SST廣泛分布于大多數(shù)人體器官組織，具有抑制激素分泌、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞及細(xì)胞增殖的作用。已有研究證實(shí)卵巢癌中存在生長抑素受體(SSTR)的表達(dá)，如陳懷增等［3］采用RT-PCR方法證實(shí)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及3AO均表達(dá)Ⅱ型 SSTR(SSTR2)。Hall等［4］利用免疫組織化學(xué)方法對63例惡性卵巢腫瘤和35例良性卵巢腫瘤患者的SSTR表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)SSTR在腫瘤組織上皮、間質(zhì)以及血管中均有不同程度的表達(dá)，在卵巢腫瘤組織血管壁的中膜平滑肌中亦可見SSTR的高表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)提供了SST治療卵巢癌的可能性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在給予OCT、順鉑及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后，移植瘤重量及體積均明顯低于空白對照組，但各用藥組兩兩間比較抑瘤作用無顯著性差異，提示對于卵巢癌，非化療藥OCT可能具有相當(dāng)于順鉑的抗腫瘤效果。順鉑是目前臨床治療卵巢癌患者的一線化療藥物，但其毒副反應(yīng)較大且易產(chǎn)生耐藥，而肽類化合物OCT副反應(yīng)小，可望用于對順鉑耐藥的卵巢癌患者。

腫瘤的血管生成是由腫瘤細(xì)胞分泌的各種促血管生成因子所誘發(fā)，其中VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的血管生成因子。它具有增加血管通透性、促進(jìn)不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和血管構(gòu)建及促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移等多種作用，以VEGF作為抗腫瘤血管生成治療的理想靶點(diǎn)已逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的共識。Osada等［5］的研究表明，VEGF高表達(dá)的卵巢癌患者生存率明顯低于VEGF低表達(dá)者。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色法檢測腫瘤組織內(nèi)VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示各用藥組VEGF的表達(dá)較空白對照組明顯下降，提示OCT抗腫瘤作用機(jī)制之一為抑制腫瘤新生血管生成。

據(jù)文獻(xiàn)［6-10］報(bào)道SST及SSTA抗腫瘤作用的機(jī)制可能包括:(1)通過與SSTR結(jié)合直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖;(2)抑制促腫瘤生長的激素或細(xì)胞因子的釋放;(3)抑制腫瘤血管生成;(4)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)OCT對卵巢癌細(xì)胞株的抑制作用與傳統(tǒng)抗腫瘤藥順鉑相當(dāng)，可為卵巢癌治療提供新途徑。

［1］BRAZEAU P，VALE W，BURGUS R.Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone［J］.Science，1973，179(68):77-79.

［2］GUILLERMET-GUIBERT J，LAHLOU H，GORDELIER P，et al.Physiology of somatostatin receptors［J］.J Endocrinol Invest，2005，28(11 Suppl):5-9.

［3］陳懷增，謝幸，葉大風(fēng)，等.卵巢上皮性癌生長抑素受體2表達(dá)的研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2002，37(5):306-307.

［4］HALL G H，TURNBULL L W，RICHMOND I，et al.Localization of somatostatin and somatostatin receptors in bening and malignant ovarian tumors［J］.Br Cancer，2002，87(1):86-90.

［5］OSADA R，HORIUCHI A，KIKUCHI N，et al.Expression of semaphorins，vascular endothelial growth factor，and their common receptor neuropilins and alleic loss of semaphorin locus in epithelial ovarian neoplasms:increased ratio of vascular endothelial growth factor to semaphorin is a poor prognostic factor in ovarian carcinomas［J］.Hum Pathol，2006，37(11):1414-1425.

［6］HE Y，YUAN X M，LEI P，et al.The antiproliferative effects of somatostatin receptor subtype 2 in breast cancer cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(7):1053-1059.

［7］SCHMID H A.Pasireotide(SOM230):development，mechanism of action and potential applications［J］.Mol Cell Endocrinol，2008，286(1-2):69-74.

［8］SONGGANG L，JIYU L，GONGWE I，et al.Somatostatin enhances the chemosensitivity of GBC-SD cell line to doxorubicin through arresting the cell cycle to S phase rather than through the P53/Bax-depended apoptosis way in vitro［J］.Hepatogastroenterology，2009，56(94-95):1253-1260.

［9］HUA Y P，YIN X Y，PENG B G，et al.Mechanisms and influence of octreotide-induced regulation of somatostatin receptor 2 on hepatocellular carcinoma［J］.Chemotherapy，2009，55(5):312-320.

［10］GABRIEL M，ANDERGASSEN U，PUTZER D，et al.Individualized peptide-related-radionuclide-therapy concept using different radiolabelled somatostatin analogs in advanced cancer patients［J］.Q J Nucl Med Mol Imaging，2010，54(1):92-99.