唐明，薛萌，丁磊，曹萌，王立新

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)系，江蘇南京 210009)

細(xì)胞自噬DRibbles(DRips in Blebs)是高度保守的細(xì)胞生物學(xué)行為，其分子機(jī)制從酵母細(xì)胞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞十分相似。在自噬過(guò)程中，待降解的胞漿組分及細(xì)胞器被包裹在具有雙層膜結(jié)構(gòu)自噬小體(autophagy)中，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，從而維持細(xì)胞自穩(wěn)。

DRibbles是從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，其中含有阻斷蛋白酶體降解途徑而殘留的廢蛋白(defective ribosome products，DRips)。我們前期實(shí)驗(yàn)證明，DRibbles作為腫瘤抗原載體能被DC攝取并通過(guò)交叉提呈途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，它是具有潛在價(jià)值的腫瘤疫苗載體［1］。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，p62作為多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的支架蛋白，能通過(guò)C末端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(ubiquitinassociated domains，UBA)與泛素化靶蛋白結(jié)合，并通過(guò)LRS(LC3 recognition sequence，LRS)結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合，然后由LC3介導(dǎo)將泛素化靶蛋白包裹入自噬小體，最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。因此，p62在兩種蛋白降解途徑(蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑)之間發(fā)揮著重要的橋梁作用［2］。

本研究擬構(gòu)建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、泛素-HBsAg以及p62真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DRibbles并檢測(cè)其中HBsAg含量，探討過(guò)表達(dá)p62蛋白能否提高自噬小體中泛素化蛋白(HBsAg)的含量，為優(yōu)化DRibbles腫瘤疫苗提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和主要試劑

pIRES2-EGFP質(zhì)粒由東南大學(xué)趙春杰教授贈(zèng)送;pIRES2-EGFP-p62質(zhì)粒和pCMV-HBsAg質(zhì)粒由美國(guó)波特蘭Franz癌癥研究中心Hong-Ming Hu教授贈(zèng)送;大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。小鼠泛素表達(dá)基因上游引物(Ub-f):5'-CTAGC TAGCA TGCAG ATCTT CGTGA AGAC CCT-3'(含NheⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物(Ub-r):5'-CCGCT CGAGC GCACC TCTCA GGCGA AGGA-3'(含XhoⅠ酶切位點(diǎn));HBsAg-f:5'-CCGCT CGAGA TGGAG AACAT CGCAT CAGG-3'(含 XhoⅠ酶切位點(diǎn))，HBsAg-r:5'-CCCGA ATTCT TAAAT GTAT A CCCAA AGACA AA-3'(含EcoRⅠ酶切位點(diǎn))均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?？俁NA提取試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Transgen公司;限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自MBI公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司;RPMI 1640培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體、新生牛血清購(gòu)自Invitrogen公司;HBsAg ELISA診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物技術(shù)有限公司。HepG2細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 載體的構(gòu)建

按照?qǐng)D1A示意圖構(gòu)建重組質(zhì)粒，步驟如下:以pCMV-HBsAg作為模板、HBs-f和HBs-r為上下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ與EcoRⅠ雙酶切獲得HBsAg編碼DNA片段，插入pIRES2-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建pIRES2-EGFP-HBsAg重組質(zhì)粒，以PCR法、酶切進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。獲取BALB/c小鼠骨骼肌組織，加3 ml Lysis Buffer后用勻漿器將組織磨碎，按總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后以Ub-f和Ub-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增小鼠泛素編碼基因，純化PCR產(chǎn)物并經(jīng)NheⅠ與XhoⅠ雙酶切后插入pIRES2-EGFP-HBsAg質(zhì)粒構(gòu)建Ub-HBsAg融合表達(dá)質(zhì)粒，以PCR法、酶切法進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.3 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)種細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)3組、每組2塊細(xì)胞培養(yǎng)皿:(1)pIRES2-EGFP-HBsAg質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組，(2)pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組，(3)pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg和pIRES2-EGFP-p62共轉(zhuǎn)染組。將pIRES2-EGFP-HBsAg重組質(zhì)粒(36 μg)、pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg 重組質(zhì)粒(36 μg)以及 pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒(36 μg)和pIRES2-EGFP-p62重組質(zhì)粒(18 μg)的混合液分別溶于3個(gè)盛有3 ml Opti-MEM的離心管中，再分別向3個(gè)離心管中加入已經(jīng)室溫孵育5 min的LipofectamineTM2000脂質(zhì)體的Opti-MEM稀釋液3.06 ml，混勻后室溫放置20 min。按前述分組分別向每個(gè)培養(yǎng)皿中滴加3.33 ml質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合液，混勻后置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，約6 h后換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.4 對(duì)HepG2細(xì)胞DRibbles中HBsAg含量的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染24 h后分別更換2種不同的細(xì)胞培養(yǎng)液:正常培養(yǎng)基和含萬(wàn)珂 (100 μmol·L－1)、雷帕霉素(10 μmol·L－1)、氯化銨(2 mmol·L－1)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液并提取DRibbles［1］。采用常規(guī)ELISA法檢測(cè)各組DRibbles中HBsAg水平。

2 結(jié) 果

2.1 pIRES2-EGFP-HBsAg 和 pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

采用PCR法從pCMV-HBsAg質(zhì)粒上擴(kuò)增HBsAg基因編碼片段，電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大約為700 bp，與理論值吻合(圖1B)。采用RT-PCR法從BALB/c小鼠骨骼肌細(xì)胞中擴(kuò)增小鼠泛素蛋白編碼基因，電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大約為250 bp，與理論值吻合(圖1C)。

采用 XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切法鑒定 pIRES2-EGFP-HBsAg重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物大約為680 bp，與理論值相符(圖1D);采用 NheⅠ、EcoRⅠ對(duì)pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切法鑒定，酶切產(chǎn)物位于910 bp位置，與理論值相符(圖1E)。對(duì) pIRES2-EGFP-HBsAg和 pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg質(zhì)粒分別進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示HBsAg和Ub-HBsAg編碼基因序列正確、讀碼框架準(zhǔn)確(圖1F、G)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其表達(dá)的鑒定

熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染率大約為15%(圖2)，各組間無(wú)明顯差異。提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞能表達(dá)靶蛋白，相同的轉(zhuǎn)染率為后續(xù)組間比較DRibbles中HBsAg含量奠定了基礎(chǔ)。

圖1 pIRES2-EGFP-HBsAg和pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig 1 Construction of HBsAg and Ub-HBsAg expressing vectors

圖2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞 ×200Fig 2 Fluorescence images of transfected HepG2 cells ×200

2.3 DRibbles中HBsAg含量的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染24 h后，3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別更換正常培養(yǎng)液和含萬(wàn)珂(100 μmol·L－1)、雷帕霉素(10 μmol·L－1)以及氯化銨(2 mmol·L－1)的培養(yǎng)液，繼續(xù)16 h后提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的DRibbles，然后采用ELISA法檢測(cè)HBsAg的含量。結(jié)果顯示，pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞 DRibbles中HBsAg含量明顯低于pIRES2-EGFP-HBsAg單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DRibbles，萬(wàn)珂、雷帕霉素和氯化銨處理pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，DRibbles中HBsAg顯著增高。提取Ub-HBsAg和p62表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的DRibbles，檢測(cè)發(fā)現(xiàn):其中HBsAg含量與pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒(méi)有明顯差異，但經(jīng)藥物處理后DRibbles中HBsAg的含量顯著提高，而且明顯高于藥物處理的pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨(dú)轉(zhuǎn)染組。提示蛋白酶體阻斷劑(萬(wàn)珂)能阻斷蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白(HBsAg)的降解，過(guò)表達(dá)p62能提高自噬小體中泛素化蛋白(Ub-HBsAg)的含量。見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)HepG2細(xì)胞DRibbles中HBsAg含量的檢測(cè)Fig 3 Test of HBsAg in DRibbles extracted from HepG2 cell line

3 討 論

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)降解時(shí)間的長(zhǎng)短，可將腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白分為長(zhǎng)壽蛋白(long-lived proteins)和短壽蛋白(short-lived proteins)兩大類［3－8］。長(zhǎng)壽蛋白為細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定蛋白，其平均半衰期達(dá)3 000 min，占總蛋白的70%，其主要通過(guò)自噬等途徑被降解成游離氨基酸，進(jìn)入新蛋白的合成循環(huán)或以外排體(exosome)形式排出胞外［7－8］;短壽蛋白的平均半衰期僅為 10 min，約占總蛋白的30%，主要為一些錯(cuò)誤編碼、錯(cuò)誤翻譯等產(chǎn)生的DRips以及某些天然短壽的非結(jié)構(gòu)蛋白(short-lived proteins，SLiPs)等［5，9－12］，短壽蛋白的降解主要通過(guò)泛素-蛋白酶體(ubiquitin-proteasome)途徑。

抗原交叉提呈在腫瘤免疫、腫瘤疫苗設(shè)計(jì)等方面具有重要作用［13］。我們前期研究證實(shí)，提取含有短壽蛋白的腫瘤細(xì)胞自噬小體DRibbles作為腫瘤抗原的有效載體，可被DC等APC細(xì)胞攝取加工，通過(guò)交叉提呈的方式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答［14－15］。但如何更多地募集腫瘤細(xì)胞的短壽蛋白或泛素化蛋白以及如何優(yōu)化DRibbles腫瘤疫苗有待進(jìn)一步研究。

p62作為支架蛋白在多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，包含PB1結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger，Zinc)、TBS結(jié)構(gòu)域(TRAF6 binding site)、LIR結(jié)構(gòu)域(LC3-interacting region，LIR)和泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-associated domains，UBA)等5 個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖 4)［16］，近來(lái)研究［17－18］發(fā)現(xiàn)，p62 蛋白通過(guò) LIR 與 UBA 分別與自噬小體的跨膜蛋白LC3和泛素化蛋白的泛素結(jié)合，被認(rèn)為在兩種蛋白降解途徑(蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑)之間發(fā)揮著重要的橋梁作用［2］。p62通過(guò)“泛素-p62-LC3-自噬小體途徑”參與了泛素化蛋白的細(xì)胞自噬降解，腫瘤細(xì)胞(作為抗原供者細(xì)胞)內(nèi)“泛素-p62-LC3-自噬小體途徑”是否影響自噬小體內(nèi)泛素化蛋白的含量尚不清楚，能否利用p62分子機(jī)制優(yōu)化DRbbles中腫瘤抗原，以促進(jìn)交叉提呈也有待深入研究。

圖4 p62功能及其結(jié)構(gòu)域示意圖Fig 4 Domain organization of p62

已知，原發(fā)性肝癌與HBV感染密切相關(guān)，且尚未發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞的特異性抗原。以HBsAg為模式抗原，將為探討“p62能否增加肝癌細(xì)胞DRibbles中腫瘤抗原含量”起到示范和標(biāo)記作用，為此，本實(shí)驗(yàn)分別建立表達(dá)“HBsAg”和“短壽HBsAg”的肝癌細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從表達(dá)Ub-HBsAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取DRibbles，其中HBsAg含量很低(圖3)。萬(wàn)珂是一種蛋白酶體抑制劑，可以抑制蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白的降解。細(xì)胞經(jīng)萬(wàn)珂作用后蛋白酶體被抑制，泛素化的蛋白不能經(jīng)蛋白酶體途徑降解，變成了“長(zhǎng)壽蛋白”而由自噬途徑在溶酶體中降解。雷帕霉素是自噬誘導(dǎo)劑，氯化銨可提高溶酶體中的pH值，抑制溶酶體活性，自噬小體無(wú)法在溶酶體中降解，轉(zhuǎn)而被排出胞外成為DRibbles。加入萬(wàn)珂、雷帕霉素和氯化銨處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示，pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞DRibbles中HBsAg含量顯著增高，提示蛋白酶體抑制劑成功阻斷了蛋白酶體對(duì)Ub-HBsAg的降解。

隨后將pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg和pIRES2-EGFP-p62共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提取DRibbles并檢測(cè)HB-sAg發(fā)現(xiàn)，與pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞一樣，DRibbles中 HBsAg含量都處于較低水平，提示Ub-HBsAg主要通過(guò)蛋白酶體途徑降解，即使過(guò)表達(dá)的p62也不會(huì)募集到更多的泛素化蛋白;但經(jīng)藥物處理后，DRibbles中 HBsAg顯著增高并明顯高于pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提示當(dāng)泛素化蛋白通過(guò)自噬途徑降解時(shí)，p62蛋白能將更多的Ub-HBsAg募集到自噬小體中。

總之，阻斷蛋白酶體途徑降解，p62能將更多的短壽蛋白募集到DRibbles中，這為提高DRibbles疫苗中的抗原含量提供了新的技術(shù)途徑。

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