王 宇，王晶英

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

在培育水曲柳 (Manchurian ash)人工林過程中發(fā)現(xiàn)，許多因素對(duì)水曲柳的成活與幼樹生長(zhǎng)起著重要的抑制作用，特別是霜凍，輕者使當(dāng)年生長(zhǎng)量降低，重者使整株林木死亡。因此，研究水曲柳在低溫脅迫下受害和抗寒性機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上提出有效的防止技術(shù)措施，對(duì)培育和保護(hù)水曲柳人工林具有重要意義。

ABA是一種廣泛存在的植物激素，對(duì)逆境脅迫有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ABA含量迅速增加，促使大量ABA誘導(dǎo)基因表達(dá)［1］。ABA可以提高植物的多種抗逆性。其抗逆機(jī)理主要包括:①通過保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，維持膜功能和誘導(dǎo)抗冷基因表達(dá)而增強(qiáng)植株抗冷性;②ABA是在脅迫后的恢復(fù)過程中起信號(hào)傳導(dǎo)的作用［2］;③在脅迫環(huán)境中，ABA可參與一系列相關(guān)生理活動(dòng) (如氣孔運(yùn)動(dòng)、光合調(diào)控等)和基因的表達(dá)，從而緩解脅迫帶來的傷害［3］;④促進(jìn)多種抗氧化酶的活性。外源ABA能顯著提高黃瓜幼苗葉片過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶 (CAT)和超氧化物歧化酶 (SOD)的活性，有效緩解鹽脅迫引起的黃瓜幼苗葉片細(xì)胞的膜脂過氧化［4］。外源施加ABA可以導(dǎo)致內(nèi)源ABA的增加，從而刺激抗脅迫系統(tǒng)啟動(dòng)，提高植株的抗氧化能力［5］。

低溫是限制地球上植物分布和生產(chǎn)的重要因子之一，受冷害后的植物在膜透性、SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量等方面都有著相似的變化。研究ABA對(duì)于水曲柳常溫和低溫脅迫中葉片生理指標(biāo)的變化，對(duì)于提高水曲柳的抗寒性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2008年4月栽植3 a生水曲柳 (Manchurian ash)苗木，每盆三棵，共50盆，盆高為21 cm，上口直徑為29 cm，土壤為經(jīng)過消毒的大棚土壤。在自然條件下生長(zhǎng)，常規(guī)管理。

1.2 處理方法

1 .2 .1 人工低溫處理

2008年7月噴施不同濃度的ABA(0 mg/L、10 mg/L、30 mg/L和60 mg/L)每種濃度為3盆，噴后第1 d、5 d、10 d和15 d分別采集一定帶葉枝條，將帶葉枝條分為兩部分，一部分立即測(cè)定葉片質(zhì)膜相對(duì)透性、超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，SOD)、過 氧 化 物 酶 (Peroxidase，POD)、可溶性糖含量、水溶性蛋白質(zhì)含量的變化，另一部分于0℃的低溫處理24 h后測(cè)定上面各項(xiàng)生理指標(biāo) (由于之前預(yù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)低溫為 －7℃、0℃和4℃，依照實(shí)驗(yàn)效果最終確立為0℃)。

1 .2 .2 季節(jié)低溫處理

9月18日、19日連續(xù)2 d分2次對(duì)盆栽水曲柳幼苗進(jìn)行葉面噴施ABA處理 (0 mg/L、10 mg/L、30 mg/L和60 mg/L)，每種濃度為3盆幼苗，噴后第一天開始分別采集帶葉枝條測(cè)定和分析其葉片相對(duì)電導(dǎo)率，記錄當(dāng)天大氣溫度。隨著氣溫下降重復(fù)實(shí)驗(yàn)共做3次，以將自然低溫與人工低溫進(jìn)行比較，驗(yàn)證人工低溫試驗(yàn)中所得結(jié)論。噴后共測(cè)3次電導(dǎo)率，大氣溫度分別是:13～25℃、4～16℃和3～13℃。

1 .2 .3 各生理指標(biāo)測(cè)定方法

質(zhì)膜相對(duì)透性以相對(duì)電導(dǎo)率表示，采用電導(dǎo)法測(cè)定［6］?？扇苄蕴呛坎捎幂焱噭┓y(cè)定［6］?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量采用G－250法測(cè)定［6］。SOD活性采用氮藍(lán)四唑 (NBT)法測(cè)定［7］。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［8］。

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的整理和示圖制作及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 季節(jié)低溫處理下電導(dǎo)率的變化

膜透性可以作為表征細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的主要特征，所以可以利用自然低溫條件下的電導(dǎo)率變化情況來初步證實(shí)不同濃度ABA對(duì)于水曲柳抗寒力的影響。由圖1可知，在自然低溫條件下，對(duì)照組隨著溫度的不斷降低，季節(jié)低溫處理的天數(shù)不斷增加，電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)。因?yàn)樵谧匀坏蜏貤l件下，溫度逐漸下降，膜從液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，膜收縮，出現(xiàn)裂縫，因此使膜透性劇增，導(dǎo)致電導(dǎo)率上升。10 mg/LABA處理組電導(dǎo)率與對(duì)照組相比，都隨噴施天數(shù)的增加而呈顯著下降趨勢(shì)。30 mg/L ABA有一定程度的下降趨勢(shì)，高濃度的60 mg/LABA與對(duì)照相比下降不太顯著。可以初步認(rèn)為低濃度的ABA可以緩解電導(dǎo)率的上升速率，對(duì)于維持膜透性的穩(wěn)定具有顯著作用。

圖1 季節(jié)低溫處理下電導(dǎo)率的變化Fig.1 Changes of conductivity under seasonal low-temperature treatment

2.2 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下細(xì)胞膜透性的影響

由圖2可知，常溫和低溫相比，對(duì)照組電導(dǎo)率總體來說有上升趨勢(shì)，第1 d、5 d和15 d，對(duì)照組電導(dǎo)率低溫要高于常溫。但第10 d，低溫要低于常溫，原因可能是低溫導(dǎo)致的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生膜磷脂均勻收縮，膜的透性變小，外滲電導(dǎo)率就變小?？傮w來說ABA能夠比較顯著降低電導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)第1 d，常溫和低溫相比，3種不同濃度的ABA處理組均能降低電導(dǎo)率，高濃度效果更顯著;第5 d，中、高濃度能夠降低電導(dǎo)率，低濃度的ABA處理無(wú)顯著變化;第10 d，整體無(wú)顯著變化規(guī)律;第15 d，3種濃度均能降低電導(dǎo)率，不同濃度間作用效果無(wú)顯著差異。說明ABA可以降低電導(dǎo)率，一定程度上減輕細(xì)胞膜損傷，人工低溫下，較高濃度的效果比低濃度的更明顯一些。

圖2 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下細(xì)胞膜透性的影響Fig.2 Effects of ABA on the membrane permeability under normal temperature and low－temperature stress conditions

2.3 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下葉片蛋白質(zhì)含量的影響

低溫脅迫會(huì)對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生一定的影響。如圖3所示，與常溫條件下相比，0℃低溫時(shí)蛋白質(zhì)總體上呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)含量下降的趨勢(shì)。由圖3可知，在常溫條件下，10 mg/L ABA處理組蛋白質(zhì)與對(duì)照組相比，都隨噴施天數(shù)的增加而呈顯著上升趨勢(shì)。在第1 d和第5 d時(shí)，蛋白質(zhì)含量沒有對(duì)照組高;但第10 d和第15 d的實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照相比，出現(xiàn)了較顯著的蛋白質(zhì)含量的提高。30 mg/L ABA與60 mg/L ABA在常溫條件下與對(duì)照組相比，在第1 d和第5 d中無(wú)顯著變化，在實(shí)驗(yàn)后期中有少量的提高蛋白質(zhì)含量的作用。說明10 mg/L濃度的ABA在常溫下有提高蛋白質(zhì)的作用。而其他濃度的ABA提高作用效果不明顯。在低溫條件下，10 mg/LABA同樣有一個(gè)很顯著的上升趨勢(shì)。說明低濃度的ABA可以增加可溶性蛋白質(zhì)含量，對(duì)于提高水曲柳的抗低溫適應(yīng)能力具有一定的效果。而高濃度的變化不大，可能因?yàn)闈舛冗^高會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生抑制作用。

2.4 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下葉片可溶性糖含量的影響

溫度下降會(huì)對(duì)可溶性糖含量產(chǎn)生一個(gè)顯著的影響。由圖4可知，可溶性糖顯著增多，0℃對(duì)照組平均數(shù)上升了16%。由于低溫脅迫下，淀粉水解成糖比較旺盛，所以植物體內(nèi)的淀粉減少，而可溶性糖會(huì)顯著增多，對(duì)于抗寒有良好效果。但圖4中無(wú)論在常溫還是0℃低溫條件下，3種濃度的ABA處理組可溶性糖與對(duì)照組相比，都沒有顯著變化。可能說明外施ABA在提高水曲柳抗寒能力的作用機(jī)理上，并不表現(xiàn)在提高可溶性糖含量方面上。

圖3 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of ABA on the blade protein content under normal temperature and low-temperature stress conditions

圖4 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下葉片可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of ABA on the blade soluble sugar content under normal temperature and low-temperature stress conditions

2.5 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下葉片保護(hù)酶(SOD、POD)活性的影響

保護(hù)酶活性變化也是低溫脅迫環(huán)境中抗寒力程度的重要指標(biāo)。兩種保護(hù)酶 (SOD，POD)活性在不同處理、不同溫度、不同時(shí)間上均受到影響。在常溫條件下，3種濃度的ABA處理組SOD活性與對(duì)照組相比，都有一定程度的升高。其中10 mg/L ABA與30 mg/L ABA處理組上升的趨勢(shì)更明顯一點(diǎn)。60 mg/L ABA與對(duì)照相比，能夠提高SOD酶的活性，但作用效果沒有低濃度的ABA好。而10 mg/L ABA處理組POD與對(duì)照組相比，隨噴施天數(shù)的增加而呈顯著上升趨勢(shì)。說明常溫時(shí)低濃度ABA可一定程度上提高保護(hù)酶的活性。在0℃條件下，10 mg/L ABA與30 mg/L ABA處理組在SOD酶方面作用效果與常溫相似，說明低濃度ABA提高保護(hù)酶SOD活性效果比較明顯。10 mg/L ABA處理POD與對(duì)照組相比有比較明顯的上升趨勢(shì)。但除了第5 d時(shí)，常溫與0℃低溫POD活性與對(duì)照組相比都出現(xiàn)了一定的下降，具體原因有待分析。而兩種高濃度的POD活性出現(xiàn)了一定的下降趨勢(shì)?？赡軡舛冗^高對(duì)于POD有抑制作用。總體來說，10 mg/L ABA對(duì)于保護(hù)酶活性的提高效果最好，能一定程度緩解和提高酶的活性。如圖5所示。

圖5 脫落酸對(duì)常溫和低溫脅迫條件下葉片保護(hù)酶 (SOD、POD)活性的影響Fig.5 Effects of ABA on the blade SOD and POD activity under normal temperature and low-temperature stress conditions

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫條件下水曲柳幼苗電導(dǎo)率有兩種變化。一種是在低溫條件下，電導(dǎo)率出現(xiàn)的是上升的趨勢(shì)。另一種是在溫度下降的情況下，電導(dǎo)率出現(xiàn)過下降的情況。相對(duì)電導(dǎo)率升高是因?yàn)榈蜏貙?duì)植物進(jìn)行傷害，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，膜收縮，出現(xiàn)裂縫，因此使膜透性劇增，導(dǎo)致電導(dǎo)率上升。這與張吉立等人在冬季自然條件下4種彩葉植物抗寒生理研究中的研究結(jié)果變化趨勢(shì)相似［9］。相對(duì)電導(dǎo)率有時(shí)出現(xiàn)降低，是因?yàn)槟婢抄h(huán)境中，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)膜磷脂發(fā)生變化，如果膜磷脂是均勻收縮的話就會(huì)使膜透性減小，從而相對(duì)電導(dǎo)率也降低。這與王晶英在黑龍江東部山區(qū)水源涵養(yǎng)林樹種水分適應(yīng)性研究中的研究成果相一致［10］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的ABA處理對(duì)于可溶性糖含量的影響不大，但是許多實(shí)驗(yàn)中證明，在溫度下降的時(shí)候，淀粉水解成糖比較旺盛，可溶性糖含量增多，有利于抗寒，所以可溶性糖也是測(cè)定植物抗冷性的一個(gè)重要指標(biāo)。在邱乾棟等人的研究結(jié)果中可以證明這一點(diǎn)［11－14］。但是在本實(shí)驗(yàn)中外源ABA也并不是不對(duì)可溶性糖產(chǎn)生任何影響，在實(shí)驗(yàn)后期中，3種濃度的ABA處理組與對(duì)照組相比，可溶性糖有了一些提高。3種不同濃度的提高相比較，高濃度的ABA提高的幅度要大一些?？赡苷f明ABA對(duì)于可溶性糖的影響比較緩慢，而且開始起作用的外源ABA需要的量要高一些。

研究結(jié)果表明，在低溫脅迫下，10 mg/L濃度的ABA預(yù)處理能夠有效緩解低溫條件下水曲柳葉片電導(dǎo)率的下降速度;對(duì)于蛋白質(zhì)的積累具有很大的促進(jìn)作用，其他濃度的處理無(wú)顯著變化;3種濃度的ABA處理對(duì)于可溶性糖的增加都沒有顯著作用;保護(hù)性酶 (SOD、POD)活性變化方面，不同濃度的ABA處理都能夠升高SOD酶的活性，其中10 mg/L濃度處理的葉片效果最明顯。10 mg/L濃度的ABA處理可以顯著提高POD酶的活性，但其他兩個(gè)高濃度的處理對(duì)于POD的活性有抑制作用，POD活性出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。在自然低溫下，3種濃度的ABA處理都可以降低水曲柳葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，其中較高濃度的作用效果更加顯著一些。綜合各個(gè)生理指標(biāo)的變化，ABA提高水曲柳幼苗抗寒性的效果與其濃度密切相關(guān)，在一定濃度范圍內(nèi)ABA提高水曲柳幼苗抗寒性的效果顯著，但濃度過高效果不再明顯，在本實(shí)驗(yàn)中濃度為10 mg/L時(shí)效果最佳。

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