潘 勇 舒洪權(quán) 顏景穎

1.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518001；2.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035；3.深圳市福永醫(yī)院，廣東 深圳 518103

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因未明的以大腸黏膜和黏膜下層炎癥病變?yōu)橹饕卣鞯穆约膊。弥斡?，反?fù)發(fā)作，近年來發(fā)病率在我國呈不斷上升趨勢。其病因和發(fā)病機制尚不十分清楚，目前認(rèn)為主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素的相互作用有關(guān)。細(xì)胞因子在UC發(fā)病中的重要作用，越來越引起人們的關(guān)注，大量的研究提示潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）患者有免疫異常[1-3]，如血中的抗結(jié)腸抗體[3]，循環(huán)免疫復(fù)合物等[2]，有人甚至認(rèn)為它是一種自身免疫病，目前認(rèn)為促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)所致的免疫異常是UC的重要發(fā)病機制，在促炎因子中具有代表性的是IL-1、IL-6、TNF-α等，抗炎因子中具有代表性的是IL-4、IL-10等。目前對UC尚無滿意的治療手段，而中醫(yī)藥具有毒副作用小，遠(yuǎn)期療效好等優(yōu)勢，本實驗主要觀察經(jīng)驗方結(jié)腸康Ⅰ號對UC大鼠結(jié)腸損傷的修復(fù)作用及血清IL-6、IL-10水平的影響，從而進一步驗證該藥的療效，探討其治療UC的免疫機理。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

結(jié)腸康I號（主要由黃芪20g、黨參20g、白術(shù)15g、茯苓12g、白頭翁12g、秦皮6g、木香10g、地榆8g、元胡8g、白芍12g、甘草3g組成），由深圳市長白山制藥廠提供，批號20081012，實驗前用蒸餾水配制成100%（1g/ml）的濃度。IL-6、IL-10放免試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供。磷酸緩沖溶液500毫升；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司產(chǎn)品）。乙醇為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

健康SD大鼠60只，體重200～220克，雌雄各半，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。隨機分為4組，每組15只，雌雄各半，分別是正常組、模型組、結(jié)腸康I號大、小劑量組。

2 實驗方法

2.1 UC大鼠模型制備

除正常組外，其余各組大鼠造模前禁食不禁水48小時，禁食24小時后提起鼠尾將其懸空，使掙扎以排出大腸遠(yuǎn)端的大便，共2次，每次相隔6小時以上，以氯氨酮（0.2ml/100g）腹腔注射麻醉大鼠，用外徑為2mm的硅膠管插入鼠肛內(nèi)約8cm，經(jīng)管內(nèi)注入5%2.4、6-三硝基苯磺酸水溶液0.4ml（100mg/kg）+50%乙醇0.25ml，約10秒灌注完畢。

2.2 給藥及取材

造模完成（第3天）后，結(jié)腸康I號大、小劑量組，每組每只大鼠分別用配制的結(jié)腸康I號液2.5ml、5ml灌胃，每天兩次；正常組、模型組每組每只大鼠均以蒸餾水3ml灌胃，每天一次，以上均給藥15天。四組大鼠分別給予藥物和蒸餾水灌胃15天后，于第16天分別眼球取血2毫升待測。截取距肛門8cm處結(jié)腸，用10%甲醛固定，肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)、結(jié)腸黏膜損傷情況。常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。分離血清，-20℃保存，采用放射免疫法，嚴(yán)格按試劑盒說明書檢測血清IL-6、IL-10水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，進行兩樣本均數(shù)差別的t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 實驗動物數(shù)量分析

60只大鼠，模型組死亡1只，存活大鼠全部進入結(jié)果分析。

3.2 結(jié)腸大體形態(tài)改變

正常組大鼠表現(xiàn)為腸道不增厚，皺襞紋理清晰，黏膜光滑潤澤，腸道無粘連，未見充血、糜爛及潰瘍。模型組大鼠可見結(jié)腸長度縮短、腸道粘連，腸脹氣，局部充血，腸壁增厚，纖維化，可見明顯潰瘍。結(jié)腸康I號低、高劑量組較模型組均有改善，其中結(jié)腸康I號高劑量組大部分未見明顯潰瘍。

3.3 結(jié)腸病理組織學(xué)改變

正常組大鼠結(jié)腸上皮完整，結(jié)構(gòu)清晰，固有層杯狀細(xì)胞豐富，腺體排列規(guī)則，偶有微量炎細(xì)胞浸潤，無充血、水腫，無潰瘍。模型組大鼠結(jié)腸全層普遍增厚，黏膜層缺失，杯狀細(xì)胞顯著減少，腺體破壞，有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及數(shù)量不等的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，可見纖維組織增生。結(jié)腸康I號低、高劑量組黏膜缺損、細(xì)胞浸潤較模型組明顯減輕。

3.4 大鼠血清IL-6、IL-10水平變化

結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-10水平變化比較（）

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-10水平變化比較（）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 n IL-6（pg/ml） IL-10（ng/ml）正常組 10 102.12±7.24 38.78±7.09模型組 9 185.64±8.82** 18.51±3.81*低劑量組 10 151.92±5.22**△▲▲ 23.92±5.24**△▲▲高劑量組 10 114.65±6.53△△ 33.57±5.32*△△

模型組大鼠血清IL-6含量明顯高于正常組，IL-10含量明顯低于正常組，兩組比較有顯著性差異（P＜0.01）。低劑量組IL-6及IL-10含量與模型組比較有差異（P＜0.05），高劑量組大鼠血清IL-6含量低于模型組，IL-10含量高于模型組，有非常顯著性差異（P＜0.01）。低劑量組IL-6、IL-10的含量與高劑量組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

4 討論

細(xì)胞因子分促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子正常人群中這兩類細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)目前兩者之間的平衡失調(diào)所致免疫異常被視為UC的重要發(fā)病機制。IL-6是重要的促炎癥細(xì)胞因子，它是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多向性細(xì)胞因子，可由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)活性。它可以加強終末B細(xì)胞的分化、介導(dǎo)免疫球蛋白的分泌、提高T細(xì)胞活化信號及促進細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞溶解細(xì)胞的能力。研究發(fā)現(xiàn)UC患者的血清IL-6水平明顯升高，且與病變范圍和病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[2-3]。IL-10是由輔助性T細(xì)胞亞群TH1和TH2、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞（keratinocyte）產(chǎn)生的多效性抑炎細(xì)胞因子，其生物活性廣泛，其生物學(xué)作用是抑制炎癥反應(yīng)和致炎細(xì)胞因子的釋放、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的增殖和分化。有研究顯示，在UC患者結(jié)腸中，T淋巴細(xì)胞IL-10mRNA水平顯著升高，IL-10陽性細(xì)胞出現(xiàn)的頻率增加。又有研究報道，IL-10基因剔除小鼠可自發(fā)結(jié)腸炎說明IL-10在維持正常腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

本病屬中醫(yī)“痢疾”、“腸癖”、“腸風(fēng)”、“泄瀉”、“臟毒”等范疇。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為飲食不節(jié)，情志內(nèi)傷，外感邪毒，勞倦過度等因素，都可損傷脾胃，導(dǎo)致泄瀉。久病及腎，火不溫土，脾腎陽虛，中氣不運，水濕停留；氣虛寒凝則血運無力，漸成瘀血阻滯，或濕熱蘊結(jié)損傷血絡(luò)，瘀阻腸絡(luò)。由于局部微循環(huán)障礙，日久形成腸粘膜潰瘍，糞下膿血粘液而成腸風(fēng)。究其病機，本虛標(biāo)實，以脾腎陽虛為本，寒濕停滯，濕熱蘊結(jié)，瘀血阻滯為標(biāo)。結(jié)腸康I號系著名中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科專家陳如山教授數(shù)十年治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗方，方中黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓健脾益氣，具有增強細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)作用，配以地榆、白頭翁能清熱解毒，止血止瀉，經(jīng)現(xiàn)代藥理研究表明對多種革蘭氏陰性菌，陽性菌敏感，對慢性潰瘍性結(jié)腸炎有良好的效果；木香行氣導(dǎo)滯；延胡索、白芍化瘀行滯止痛，有改善組織微循環(huán)，殺菌、抗炎，促進損傷組織修復(fù)、促進代謝等作用，地榆有較好的止血，抗炎功效。全方具有健脾益氣，補脾益腎治本，清腸祛濕、活血化瘀、行氣導(dǎo)滯治標(biāo)之功效，共同達到扶正祛邪，標(biāo)本同治的目的。本實驗表明結(jié)腸康I號對UC大鼠結(jié)腸損傷具有明顯的修復(fù)作用，并能顯著降低大鼠血清IL-6水平，提高大鼠血清IL-10含量進一步揭示了結(jié)腸康I號治療UC的藥理機制為臨床廣泛應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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