范 磊,楊金升,石向群,張明磊,王彥平,司江華,曲傳勇

丹紅注射液由紅花和丹參科學(xué)提取精制而成,主要成分為紅花黃色素、丹參酮和丹參酚等[1,2],具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)之功效,臨床上用于治療心腦血管等多種疾病。有研究表明[3,4],丹紅注射液有保護血管內(nèi)皮,促進血管再生及抑制血管內(nèi)凝血和促進纖溶活性的功能,但關(guān)于丹紅注射液影響腦缺血后神經(jīng)細胞的凋亡機制還缺少翔實的實驗研究。為此本文通過建立大鼠局灶性I/R損傷動物模型,觀察丹紅注射液對腦缺血周圍區(qū)Caspase-3、Survivin及神經(jīng)細胞凋亡的影響,旨在探討其對實驗性腦梗死腦保護作用的初步機制,為臨床合理用藥提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 局灶性腦缺血模型制作 采用線栓法制作大鼠腦缺血模型。選用Wistar大鼠,雌雄各半,體重280 g～320 g。腹腔內(nèi)注射水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉,實現(xiàn)大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。維持肛溫在37℃左右,保持呼吸道通暢。大鼠大腦中動脈梗死后2 h,參照改良的Bedersonps評分方法進行神經(jīng)功能缺失評分[5],選擇評分在2分～3分的動物進行下一步實驗。

1.2 動物分組與處理方法 將96只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丹紅注射液治療組(治療組),再各分為缺血 2 h再灌注6 h、24 h、48 h、72 h四個亞組,每個亞組8只大鼠。其中丹紅注射液治療組于腦缺血造模成功后30 min腹腔注射丹紅注射液,模型組給予等量生理鹽水,劑量5 mL/kg,每日1次,治療至各不同時間點處死取材。

1.3 標本采集和組織切片的制備 在大鼠腦缺血2 h再灌注6 h、24 h、48 h、72 h各個時間點,用 10%的水合氯醛深度麻醉動物后,經(jīng)左心室插管至升主動脈,并剪開右心耳,用生理鹽水250 mL快速沖洗,隨后用4%多聚甲醛PBS液先快后慢灌注約250 mL固定,斷頭取腦,在4%多聚甲醛PBS液中固定24 h～28 h,在視交叉前后約2 mm冠狀切取約4 mm厚腦組織切塊,置于含4%多聚甲醛PBS液中固定過夜,脫水、包埋成蠟塊。

1.4 Caspase-3和Survivin的檢測 按SABC免疫組化試劑盒說明書(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)進行操作。DAB顯色,蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對照。Caspase-3、Survivin均以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)產(chǎn)物。用Image-proplus 5.0軟件,對每張切片大腦皮質(zhì)缺血灶周圍區(qū)Caspase-3和Survivin的表達進行光密度值檢測。

1.5 細胞凋亡的檢測 細胞凋亡檢測嚴格按TUNEL試劑盒說明書(美國羅氏公司)進行操作。DAB顯色,蘇木素復(fù)染。光鏡下神經(jīng)元胞核中有棕黃色顆粒的為陽性,用Image-proplus 5.0軟件,對每張切片大腦皮質(zhì)缺血灶周圍區(qū)TUNEL陽性細胞的表達進行光密度值檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用重復(fù)測量的單因素方差分析(post-way RANOVA)比較組間差異,進一步post-hoc分析采用LSD比較兩組間差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評定結(jié)果 大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)右側(cè)Honer征,左側(cè)前肢不能伸展,走路向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或向左側(cè)傾倒,神經(jīng)功能評分2分～3分的大鼠入組。肢體癱瘓癥狀以缺血2 h再灌注6 h～24 h最顯著。

2.2 Caspase-3表達檢測結(jié)果(見表1)缺血側(cè)大鼠腦組織缺血灶周圍區(qū)于再灌注6 h即有大量Caspase-3陽性細胞表達,再灌注24 h表達進一步增加,再灌注48 h有所下降,再灌注72 h繼續(xù)下降。與模型組比較,再灌注各個時間點治療組光密度值明顯降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠缺血側(cè)(右側(cè))Caspase-3光密度值的比較(±s)

表1 各組大鼠缺血側(cè)(右側(cè))Caspase-3光密度值的比較(±s)

組別 n 6 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組 8 0.06±0.02 0.06±0.02 0.06±0.02 0.05±0.02模型組 8 0.20±0.031) 0.34±0.051) 0.25±0.041) 0.18±0.031)治療組 8 0.14±0.042) 0.30±0.052) 0.22±0.052) 0.13±0.032)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組、假手術(shù)組比較,2)P＜0.05

2.3 Survivin表達檢測結(jié)果(見表2)缺血側(cè)大鼠腦組織缺血灶周圍區(qū)于再灌注6 h即有部分Survivin陽性細胞表達,再灌注24 h表達進一步增加,再灌注 48 h達到高峰,再灌注72 h有所下降。與模型組比較,再灌注各個時間點治療組光密度值明顯升高(P＜0.05)。

表2 各組大鼠缺血側(cè)(右側(cè))Survivin光密度值的比較(±s)

表2 各組大鼠缺血側(cè)(右側(cè))Survivin光密度值的比較(±s)

組別 n 6 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組 8 0.04±0.01 0.07±0.02 0.08±0.02 0.07±0.02模型組 8 0.15±0.031) 0.21±0.041) 0.31±0.041) 0.24±0.031)治療組 8 0.18±0.042) 0.31±0.042) 0.45±0.052) 0.33±0.042)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組、假手術(shù)組比較,2)P＜0.05

2.4 T UNEL檢測結(jié)果(見表3)TUNEL陽性染色為細胞核呈棕黃色顆粒,主要見于缺血灶周圍區(qū),于再灌注6 h、24 h表達進一步增加,再灌注48 h有所下降,再灌注72 h繼續(xù)下降。與模型組比較,再灌注各個時間點丹紅注射液治療組光密度值明顯降低(P＜0.05)。

表3 各組大鼠缺血側(cè)(右側(cè))TUNEL陽性細胞光密度值的比較(±s)

表3 各組大鼠缺血側(cè)(右側(cè))TUNEL陽性細胞光密度值的比較(±s)

組別 n 6 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組 8 0.06±0.01 0.07±0.02 0.06±0.02 0.06±0.02模型組 8 0.33±0.031) 0.44±0.031) 0.33±0.041) 0.21±0.021)治療組 8 0.25±0.042) 0.33±0.052) 0.26±0.042) 0.17±0.032)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組、假手術(shù)組比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡機制是一個復(fù)雜的多因素過程,對細胞凋亡機制的探討及阻止凋亡的發(fā)生有重要的現(xiàn)實意義。Caspase-3在細胞凋亡過程中居核心地位,是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶,在各種程序啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用[6]?；罨腃aspase-3可通過切割 PARP、Actin、Fodrin、Lamin等底物,最終使細胞凋亡[7]。有研究表明,和正常大鼠相比,Caspase-3基因敲除的大鼠腦缺血2 h再灌注48 h后,皮層的梗死體積降低了55%,TUNEL陽性細胞密度下降了36%,說明Caspase-3在腦缺血再灌注細胞損傷中發(fā)揮了重要作用。另有文獻報道,在缺血缺氧性腦損傷及腦缺血再灌注損傷中,應(yīng)用Caspase-3抑制劑可有效地減少腦缺血后神經(jīng)元凋亡的數(shù)量,從而起到腦保護作用[8,9]。以上研究結(jié)果說明Caspase-3參與了缺血性腦損傷,并在缺血神經(jīng)元的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

Survivin屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族中的一員,是近來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因。目前的研究表明,Survivin主要通過以下途徑抑制細胞凋亡:一是通過直接抑制各種凋亡途徑的終末效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase-7的活性從而阻斷細胞凋亡過程[10,11]。二是發(fā)現(xiàn)Survivin能與周期蛋白激酶Cdk4及p34cdc2相互作用從而阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Survivin依賴細胞增殖信號進入核內(nèi)與Cdk4結(jié)合,導(dǎo)致p21從Cdk4中釋放出來,p21易位到線粒體與procaspase-3結(jié)合,抑制 Caspase-3的活性,從而抑制細胞凋亡。另外,Survivin與p34cdc2結(jié)合磷酸化后,與Caspase-9結(jié)合并抑制其活性,阻斷Caspase-9依賴性的細胞凋亡信號傳導(dǎo),抑制Caspase-3的活性,抑制細胞凋亡[12,13]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn),大鼠缺血2 h再灌注各個時間點模型組Caspase-3、Survivin和T UNEL陽性細胞的表達明顯增加,給予丹紅注射液治療后,治療組腦缺血2 h再灌注各個時間點與模型組相比Caspase-3、TUNEL陽性細胞表達明顯降低,Survivin表達明顯增加,提示丹紅注射液可能通過促進腦缺血后Survivin的表達,抑制Caspsae-3的表達,從而抑制 I/R誘導(dǎo)的腦細胞凋亡,最終對腦缺血損傷起到神經(jīng)細胞保護作用。但丹紅注射液作用于Caspase-3及Survivin的具體機制及是否通過其他方面發(fā)揮作用,還有待進一步研究。

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