譚 力,王聯(lián)英,向海鷹,李 鳴

卒中是現(xiàn)代社會(huì)致死致殘的主要病因之一,其中缺血性卒中占70%以上。但目前除了超早期溶栓治療外,尚無(wú)被證明療效確切的藥物[1],因此尋找有效的腦缺血保護(hù)藥物成為研究的熱點(diǎn)。大黃素(Emodin)化學(xué)名稱1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌,已有文獻(xiàn)報(bào)道其具腦缺血保護(hù)作用,機(jī)制與其對(duì)缺血后的炎癥因子的抑制作用有關(guān)[2]。但相對(duì)于腦缺血損傷復(fù)雜的機(jī)制,其保護(hù)作用及機(jī)制的探討尚不全面。本實(shí)驗(yàn)擬采用腦缺血再灌注大鼠模型,在整體和微觀層面觀察大黃素的保護(hù)作用,并通過(guò)觀察大黃素對(duì)缺血后神經(jīng)元凋亡的影響,進(jìn)一步探討作用機(jī)制,以期為大黃素的運(yùn)用提供更充實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組 健康雄性SD大鼠45只,體重250 g～320 g,由湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、大黃素組,每組15只。假手術(shù)組不作任何處理,缺血再灌注組采用線栓法行大腦中動(dòng)脈阻塞,大黃素組在術(shù)前30 min給予大黃素25 mg/kg腹腔注射。

1.1.2 試劑 水合氯醛(中國(guó),國(guó)藥試劑),大黃素,焦油紫,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(美國(guó),Sigma),TUNEL檢測(cè)試劑盒(德國(guó),Roche),caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(上海,碧云天)。

1.1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡(日本,Olympus),電子分析天平(德國(guó),Sartorius),Ultrospec 4000紫外分光光度計(jì)(加拿大,SpectraLab Scientific),高速冷凍離心機(jī)(美國(guó),Beckman),石蠟切片機(jī)(德國(guó),Leica)。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注模型制作 參照Z(yǔ)ea longa[3]的大腦中動(dòng)脈線栓法,采用水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg,IP)麻醉大鼠后,分離出左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,在頸外動(dòng)脈兩結(jié)扎線間剪一小口,將線栓(栓頭涂有硅膠,直徑0.28 mm)經(jīng)切口插入頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,一直進(jìn)入17 mm～19 mm時(shí)會(huì)遇到輕微阻力感,此時(shí)結(jié)扎備用線將線栓固定在頸外動(dòng)脈,縫合皮膚。2 h后拔出線栓形成再灌注。假手術(shù)組不插入尼龍絲線,其他操作步驟同上。造模成功標(biāo)準(zhǔn):同側(cè)即刻出現(xiàn)Honer征,對(duì)側(cè)肢體功能障礙。

1.2.2 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 參照Z(yǔ)ea longa[3]的方法,缺血2 h再灌注后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,無(wú)功能障礙;1分,不能伸展前肢;2分,向一側(cè)旋轉(zhuǎn);3分,向一側(cè)傾倒;4分,無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制。不足1分者為造模不成功。

1.2.3 腦梗死體積 采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(T TC)染色。缺血2 h再灌注后24 h水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠斷頭取腦,切成厚度為2 mm的腦片,置于2%TTC染液中37℃避光染色15 min,計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)測(cè)量每一腦切片尾側(cè)面的梗死面積,將各腦片的梗死面積之和乘以腦片厚度,即為整個(gè)梗死灶的體積。

1.2.4 組織病理染色 石蠟切片制作,Nissl染色,TUNEL染色,采用TUNEL試劑盒,按說(shuō)明書步驟操作。高倍鏡(×400)下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 Caspase-3活性 采用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒,缺血2 h再灌注24 h取大鼠腦組織水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,按照每3 mg～10 mg組織加入100μ L裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,冰浴再裂解5 min,4℃16 000 g離心10 min～15 min后,把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中,分光光度計(jì)測(cè)定Caspase-3的活性。

2 結(jié) 果

2.1 大黃素減少腦梗死體積及神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組有明顯的神經(jīng)功能缺損及梗死灶形成。而大黃素則能顯著改善缺血引起的神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死體積,提示大黃素具有腦缺血保護(hù)作用。詳見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、腦梗死體積比較(±s)

表1 各組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、腦梗死體積比較(±s)

組別 n 神經(jīng)功能缺陷(分)腦梗死體積假手術(shù)組 5 0 0缺血再灌注組 5 2.82±0.21 181.45±19.37大黃素組 5 2.06±0.141) 120.52±14.501)與缺血再灌注組比較,1)P＜0.01

2.2 大黃素減輕腦組織損傷 Nissl染色顯示假手術(shù)組腦組織無(wú)水腫、充血,腦組織呈均勻一致的紫藍(lán)色,細(xì)胞密度大,神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,為三角形、長(zhǎng)條形或多邊形,胞漿染色清晰,尼氏體著藍(lán)色,胞核淡染,無(wú)明顯神經(jīng)元丟失;缺血再灌注組大腦皮層可見(jiàn)較明顯的充血,血管周圍間隙增寬,細(xì)胞間質(zhì)水腫,神經(jīng)元皺縮體積縮小,與周圍組織脫離,胞核固縮深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,部分神經(jīng)元腫脹,胞漿呈空泡狀;大黃素組可見(jiàn)少量神經(jīng)元腫脹,少量神經(jīng)元皺縮、胞核固縮深染,細(xì)胞密度較大,與模型組比較神經(jīng)元損傷減輕、丟失減少,提示大黃素改善腦缺血損傷。

2.3 大黃素減少神經(jīng)元凋亡 缺血 2 h再灌注24 h的TUNEL染色結(jié)果表明,假手術(shù)組僅見(jiàn)極少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,而缺血再灌注組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則顯著增多,大黃素組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示大黃素對(duì)缺血再灌注后的神經(jīng)元凋亡具有抑制作用。詳見(jiàn)表2。

表2 各組T UNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s)

表2 各組T UNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s)

組別 n T UNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞數(shù)/視野)假手術(shù)組 5 8.4±2.4缺血再灌注組 5 87.5±11.3大黃素組 5 33.9±6.01)與缺血再灌注組比較,1)P＜0.01

2.4 大黃素抑制Caspase-3活性 缺血2 h再灌注24 h的結(jié)果表明,缺血導(dǎo)致Caspase-3活性顯著升高,從假手術(shù)組的0.12±0.07上升到缺血再灌注組的1.33±0.25,大黃素組則顯著降低至0.56±0.11,表明大黃素對(duì)缺血引起的Caspase-3活化及其活性升高具有抑制作用。

3 討 論

通過(guò)整體和微觀研究,觀察了大黃素的腦缺血保護(hù)作用。大黃素能顯著改善缺血2 h再灌注24 h的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分,減少腦梗死體積,顯著減輕缺血引起的腦組織損傷。

腦缺血損傷是由腦血流減少或中斷引起的,缺血引起的神經(jīng)元死亡包括壞死和凋亡兩種途徑[4]。壞死多發(fā)生于較嚴(yán)重的缺血以及缺血中心,而凋亡多發(fā)生于較緩和的缺血以及缺血周邊(或缺血半暗帶),缺血周邊的細(xì)胞可存活數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天,因此抑制神經(jīng)元凋亡有利于改善腦缺血損傷[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明多種凋亡抑制劑通過(guò)抑制缺血周邊或者缺血半暗帶的細(xì)胞凋亡而減少腦梗死體積,進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的改善[5]。目前已知細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括細(xì)胞外病理途徑(死亡受體途徑)和細(xì)胞內(nèi)病理途徑(線粒體途徑)兩種途徑。這兩種途徑都最終依賴于Caspase-3的活化,Caspase-3在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位,是凋亡的最終執(zhí)行者[6]。Caspase-3通常以無(wú)活性的酶原形式存在,在上述兩種途徑下被活化,因此抑制Caspase-3活性就能抑制凋亡的發(fā)生,多種Caspase-3抑制劑的運(yùn)用以證明了這一點(diǎn)[7]。本研究于缺血2 h再灌注24 h檢測(cè)了大鼠的神經(jīng)元凋亡,以及Caspase-3的活性,結(jié)果表明大黃顯著減少腦缺血區(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,而這一結(jié)果與Caspase-3活性的降低有關(guān)。

大黃素能改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分,減少腦梗死體積,減少神經(jīng)元凋亡,而這一作用與大黃素對(duì)Caspase-3活性的抑制作用有關(guān)。

[1]巫志峰,羅翠霞,孫靜,等.大黃素對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織NF-κ B、ICAM-1基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2009,18(6):934-936.

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