劉 妮,謝道俊,曹仕健,陳永華,江停戰(zhàn),汪遠金,

胡業(yè)彬,李之和,黃 為,尹良勝,王莉莉

腦缺血后神經細胞凋亡的發(fā)生機制尚未完全明了,可能與腦缺血再灌注時氧自由基增多、鈣超載及興奮性氨基酸釋放有關,但更重要和更直接的是凋亡細胞內活躍的基因表達。原癌基因尤其是c-fos和c-jun在細胞生長調節(jié)和胞內信號傳遞分泌中具有極為重要的作用。細胞凋亡控制基因在腦缺血損害中參與凋亡的發(fā)生,升高的c-fos和c-jun參與神經細胞凋亡[1]。本研究基于腦缺血再灌注損傷后的血管性癡呆(VD)大鼠模型,探討中藥黃蒲通竅膠囊對VD大鼠學習記憶相關基因,同時也是神經細胞凋亡相關調控基因c-fos和c-jun的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗于2004年5月在安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院實驗中心進行。選用健康成年雄性Wistar大鼠100只,體質量(300±20)g,由河南醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號:豫醫(yī)動字410157號。

1.2 藥物及試劑 黃蒲通竅膠囊(主要由人參、大黃、益智仁等組成)由安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院提供,批號:20030816,0.4 g,實驗前將黃蒲通竅膠囊內粉溶于蒸餾水中,配成0.084 g/mL的濃度;都可喜(Duxil,每片含阿米三嗪30 mg及蘿巴新10 mg):法國施維雅(SERVIER,批號:2M0153)藥廠,溶于蒸餾水中,配成0.7 g/mL濃度的溶液,冰箱保存。c-fos和 c-jun多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物公司。

1.3 主要儀器 電子天平FA2104MAX210型由上海儀器廠生產;S?C202型電熱恒溫干燥箱由浙江省嘉興市新騰電器廠生產;KDC-2046低速冷凍離心機。

1.4 干預措施 參照 Nagasawa等[2]和Zea Longa等[3]的方法加以改進制作線栓法大腦中動脈栓塞模型。阻斷該側大腦中動脈的血流導致腦缺血。再次結扎入口處,尼龍線外留約1 cm,縫合皮膚。2 h后輕輕提拉所留線頭至有阻力實現大腦中動脈再灌,則造模完成。假手術組手術過程同上,插線深度為1.5 cm。正常組大鼠不作任何手術處理。所有手術動物縫合前切口處涂上慶大霉素溶液,術后肌肉注射青霉素2×104U/100 g,1次/日,連續(xù)3 d以預防感染。購買后適應性飼養(yǎng)1周,然后開始造模。術前、術后各禁食12 h,術后保溫飼養(yǎng)。

1.5 分組及處理 于缺血2 h～6 h內觀察動物的軀體感覺和動物功能,按Zea Longa[4]5分制為神經病學評分標準評分:0分,無神經損傷癥狀;1分,不能完全伸展對側前或后爪;2分,向手術對側轉圈;3分,向手術對側傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。1分(包括 1分)以上為造模成功,低于1分則未成功,棄去。

各組動物分組如下:空白組15只;假手術組15只。余下70只全部造模,隨機選取造模成功大鼠45只,按隨機數據表分成3組,每組15只,即模型組、中藥組(黃蒲通竅膠囊組)、陽性對照組(都可喜組)。中藥組:按臨床成人劑量的7倍給藥,即0.42 g/kg。按照大鼠體質量以0.01 ml/g的劑量灌胃給藥。陽性對照組,按照大鼠體質量以0.01 ml/g的劑量灌胃給藥?？瞻捉M、假手術組和模型組與中藥組和陽性對照治療組同時予以蒸餾水灌胃,按照大鼠體重以0.01 ml/g的劑量灌胃。各組大鼠造模結束第 2天開始給藥,1次/日,連續(xù)處理28 d。

1.6 組織處理 斷頭取腦,除去小腦和腦干,取缺血側半腦,從視交叉處冠狀面切開,放入相同的固定液中固定1周,制作腦部冠狀切片。

1.7 觀察指標 c-fos、c-jun免疫組化染色,用博士德公司推薦的SABC法。在額頂葉皮質,相近部位同倍的6個不同視野,統(tǒng)計上述3組指標的陽性細胞數、陽性細胞數占總細胞數的比率以及陽性細胞的著色深淺度,取平均值。陰性對照采用正常山羊血清替代第一抗體進行。

2 結 果

2.1 黃蒲通竅膠囊對大鼠腦組織c-fos的影響(見表1)

表1 各組大鼠腦組織c-fos的表達(±s)

表1 各組大鼠腦組織c-fos的表達(±s)

組別 陽性(個)比例(%)著色深淺(分)空白組 55.33±2.74 78.93±1.29 3假手術組 58.34±3.16 80.56±2.43 3模型組 76.17±1.983) 83.62±2.013) 4中藥組 94.33±3.342) 93.85±1.962) 4都可喜組 91.50±2.262) 89.32±2.221) 3與模型組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與空白組比較,3)P＜0.01

2.2 黃蒲通竅膠囊對大鼠腦組織c-jun的影響(見表2)

表2 各組大鼠腦組織c-jun的表達(±s)

表2 各組大鼠腦組織c-jun的表達(±s)

組別 陽性(個)比例(%)著色深淺(分)空白組 56.50±2.24 67.06±2.22 3假手術組 64.56±3.12 69.86±1.86 3模型組 65.83±2.482) 78.36±1.232) 3中藥組 83.67±1.981) 91.11±1.731) 3都可喜組 81.33±2.361) 87.32±2.041) 3與模型組比較,1)P＜0.01;與空白組比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦內神經細胞的信息傳遞經跨膜傳導機制,激活細胞內第二信使系統(tǒng),在引起細胞瞬時反應的同時,可激活第三信使,引起基因轉錄變化即刻早期基因c-fos及其所編碼的蛋白可作為核內第三信使,在神經信號的傳遞過程中起重要作用,它能將外界短時程的傳入信號和長時程的基因表達偶聯(lián)起來,調控神經細胞的多種后期效應基因表達,從而使神經細胞的可塑性及興奮性發(fā)生改變[4]。在正常情況下,c-fos在神經系統(tǒng)的表達很低,參與細胞生長、繁殖、分化、信息傳遞和人的學習、記憶等生理過程。生理性刺激和病理情況下均能短暫地誘導細胞內c-fos表達。腦缺血是即早基因強有力的誘導劑,近年的研究表明,腦缺血導致c-fos表達呈兩種方式:短暫而快速的表達[5,6],延遲的表達[7]。

c-jun與 c-fos關系密切,外界刺激后,fos和jun的mRNA可短暫地在胞漿內積累,并翻譯出相應的蛋白質fos和jun,跨核膜轉入核內,二者通過亮氨酸拉鏈形式構成1∶1異源二聚體,是fos和jun的活性形式,可與靶基因上調節(jié)區(qū)(AP1位點)結合,影響靶基因表達。已有報道,抗c-jun的低聚核苷酸可以一種程序特異性的方式影響學習記憶過程,提示c-jun在學習記憶過程中具有特異性作用[8]。

用T UNEL法在缺血側基底皮層與丘腦可見凋亡細胞,梗死中心的尾殼核只見少量散在凋亡細胞。免疫組化測得缺血側皮層與丘腦c-fos表達性增高,非梗死區(qū)的扣帶回皮層也見大量c-fos。張玲等[9]研究證實,腦缺血及再灌注損傷可誘導c-fos基因的表達,且在相同腦區(qū)內見到細胞凋亡,表明c-fos表達在細胞凋亡中可能起一定作用。國內尚有研究結果顯示腦缺血再灌注損傷可誘導c-fos和c-jun蛋白的表達,且表達區(qū)域與細胞凋亡一致,主要位于半暗帶區(qū),提示c-fos和c-jun的表達可能在腦缺血再灌注導致細胞凋亡的過程中起一定作用[10]。腦缺血后c-fos基因在神經細胞內的高表達和神經細胞凋亡關系密切。然而c-fos基因高表達在腦缺血及缺血再灌注后神經細胞凋亡中的作用機制尚未明了,兩者間的關系也存在許多爭議[11]。c-fos表達后的 Fos蛋白具有雙重效應,既可介導細胞凋亡,又能參與細胞損傷后的修復。Kamme等[12]在觀察低溫對腦缺血后神經元的影響時提出低溫可影響c-fos的表達,并可能干擾腦缺血后神經細胞凋亡的進程。王雪等[13]也提出以c-fos基因的雙效假說,認為在神經細胞系統(tǒng)修復/防御系統(tǒng)完全被抑制時,c-fos參與凋亡,未被抑制時參與神經細胞的損傷后修復。

關于腦缺血后c-fos的表達與學習記憶之間的關系,Shigeno等[14]通過對腦缺血后海馬、下丘腦神經細胞中 NGFmRNA、c-fosmRNA的觀察,揭示c-fos可能通過上調腦缺血損傷區(qū)的NGF基因表達,使腦缺血后海馬、下丘腦區(qū)的神經細胞NGF量增加,從而延遲和部分抑制了該區(qū)域的細胞凋亡進程。利用反義核酸技術抑制腦內c-fosmRNA的表達,發(fā)現c-fosmRNA對大鼠Y迷宮的學習行為沒有影響,但大鼠分辯記憶的保持能力卻明顯減弱,證實轉錄因子c-fos與長期記憶有關[15]。包新民等[16]用Y迷宮證明大鼠全腦缺血5 d后,學習記憶能力顯著降低,同時觀察到紋狀體邊緣區(qū)內的神經元明顯缺失,c-fos蛋白一過性表達增高,提示全腦缺血后導致的海馬以及邊緣區(qū)等在內的神經元損傷,可能是造成全腦缺血后學習記憶功能障礙的原因。張雪朝等[17]通過對VD大鼠的針刺干預研究,推測針刺腦、腎耳穴后,可能加強了c-fosmRNA及蛋白在海馬CA1區(qū)的表達。

本組資料結果顯示,腦缺血4周后模型組大鼠c-fos和c-jun有一定的表達,中藥組大鼠c-fos和c-jun的表達明顯增強,提示黃蒲通竅膠囊一方面可能通過上調腦缺血后某些抑制凋亡基因的表達,延遲和抑制了腦缺血后細胞凋亡的進程,而起到腦保護的作用;另一方面表達增強的Fos蛋白可能作為細胞核的第三信使,啟動和調控某些與學習記憶功能相關的基因,最終起到改善VD大鼠學習記憶障礙的作用。

黃蒲通竅膠囊具有腦保護和改善VD大鼠的學習記憶能力的作用,其確切的機制尚不清楚。但本方的現代藥理學研究證實,人參大補元氣,人參皂甙Rg-1能選擇性增強老年大鼠免疫功能,改善老年大鼠的行為活動和操作能力,提高青、老年大鼠海馬神經細胞功能,促進海馬細胞內c-fos基因的表達,并對抗谷氨酸介導的神經毒作用以及對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經細胞表現出一定的保護作用[18]。石菖蒲豁痰開竅,為治療痰蒙清竅之首品,《本經適源》謂之可“開心孔,通九竅,明耳目,出聲音,總取辛溫利竅之力”。藥理學研究表明石菖蒲對癡呆大鼠學習記憶具有改善作用,其機制可能與石菖蒲的神經元保護作用及突觸可塑性有關[19]。石菖蒲揮發(fā)油尤其是β-細辛醚有抑制大鼠神經細胞凋亡的作用[20]。石菖蒲提取物在多種實驗中有改善學習記憶障礙的作用,并能降低乙酰膽堿酯酶活力,增強c-jun基因表達[21]。這些可能是黃蒲通竅膠囊治療VD的重要機制。

[1]Gillardon F,Lenz C,Waschke KF,et al.Altered expression of bcl-2,bcl-x,bax and c-fos colocalizes with DNA fragenttation and ischemic cell damage following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Mol Brain Res,1996,40:254-260.

[2]Nagasawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989,20:1037-1043.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]T eskey GG,Atkinson BG,Gain DP.Expression of the proto-oncogene c-fos following electrical kindling in the rat[J].Brain Res Mol Brain Res,1991,11(1):1-6.

[5]Ikeda J,Nakajima T,Osborne OC,et al.Coexpression of c-fos and hsp70 mRNAS in gerbil brain after ischemia:Induction threshold,distribution and time course evaluated in situ hybridization[J].M ol Brain Res,1994,26:249-258.

[6]Kiessling M,Stumm G,Xie Y,et al.Differential transcription and translation of immediate early genes in the gerbil hippocampus after transient global ischemia[J].Cereb Blood Flow Metab,1993,13(6):914-924.

[7]Uemura Y,Kowall NW,Moskowitz A.Focal ischemia in rats causes time-dependent expression of c-fos protein immunoreactivity in widespread regions of ipsilateral cortex[J].Brain Res,1991,552:99-105.

[8]李國珍,胡俊峰.學習記憶相關基因在職業(yè)性損害機制研究中的應用[J].中華預防醫(yī)學雜志,2002,36(1):63-64.

[9]張玲,楊益階,余紹祖,等.大鼠局灶性腦缺血時細胞凋亡與c-fos表達[J].卒中與神經疾病,2000,7(2):71-74.

[10]周珂,李庚山,余紹祖.腦缺血再灌注損傷時c-fos、c-jun的表達和細胞凋亡[J].卒中與神經疾病,2003,10(1):3-6.

[11]Cho S,Park EM,Kim Y,et al.Early c-fos induction after cerebral ischemia:A possible neuroprotective role[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(5):550-556.

[12]Kamme F,Campbell K,Wieloch T.Biphasic ex pression of the fos andjan families of transcription factors following transient forebrain ischaemia in the rat.Effect of hypothermia[J].Eur J Neurosci,1995,7:2007-2016.

[13]王雪.神經細胞的生理和病理過程與原癌基因c-fos的關系[J].國外醫(yī)學:生理病理科學與臨床分冊,1998,18(4):358-361.

[14]Shigeno T,Miwa T,Takakura K,et al.Amelioration of delayed neuronal death in the hippocampus by nerve growth factor[J].J Neurosci,1991,11:2914.

[15]Grimm R,Schicknick H,Riedel,et al.Suppression of c-fos induction in rat brain impairs retention of a brightness discrimination reaction[J].Learn Mem,1997,3:402-413.

[16]包新民,舒斯云,曾建新.全腦缺血后大鼠紋狀體邊緣區(qū)原癌基因c-fos的表達及其對學習記憶功能的影響[J].第一軍醫(yī)大學學報,2001,21(10):724-727.

[17]張雪朝,呂明莊,賀志光,等.針刺對VD大鼠記憶障礙及c-fosmRNA和蛋白表達的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志,2001,16(2):74-76.

[18]劉忞.人參皂甙Rg-1抗衰老和促智作用及其機制研究[J].生理科學進展,1996,(2):139-141.

[19]景玉宏,馮慎遠,湯曉琴.石菖蒲對學習記憶的影響及突觸機制[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2002,8(6):38-40.

[20]方永奇,匡忠生,謝宇輝,等.石菖蒲對缺血再灌注腦損傷大鼠神經細胞凋亡的影響[J].現代中西醫(yī)結合雜志,2002,11(17):1647-1649.

[21]吳賓,方永奇.石菖蒲益智作用的物質基礎及其機理研究[J].中醫(yī)藥學刊,2004,22(9):1635-1640.