江小萍,李海全,潘少霞,方永奇,劉桂娥,歐陽永紅,沈祖泓

隨著溶栓、冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)及冠脈搭橋術(shù)等再灌注治療在臨床的廣泛開展,心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)越來越受到臨床的重視,減輕或避免MIRI的發(fā)生是溶栓、冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)及冠脈搭橋術(shù)成功的關(guān)鍵,也是目前冠心病治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。三七總皂甙(total panax notoginseng saponins,tPNS)是我國中藥田三七的主要藥用成分,具有對抗心肌缺血-再灌注損傷、鈣拮抗、心肌保護(hù)等[1]作用,但其分子機(jī)制并不完全明確。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)為研究對象,模擬心肌缺血再灌注環(huán)境,通過檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再給氧損傷(hypoxia/reoxygenation,H/R)后超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa-B,NF-κ B)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá)及 tPNS干預(yù)后SOD、GSH、MDA 和NF-κ B、ICAM-1表達(dá)的變化,從血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的角度探討M IRI和tPNS保護(hù)作用的機(jī)制,為MIRI提供中醫(yī)藥治療的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)液 ECV304細(xì)胞株(中山大學(xué)細(xì)胞庫);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國GIBCO);胎牛血清(美國GIBCO)。

1.2 主要試劑與儀器 SOD、MDA及GSH測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),單克隆抗體 CD54-PE、IgG-PE(美國PharMingen),flour-3/AM(美國 Biotium),流式細(xì)胞儀(美國BECKM AN COULTER公司ALTRA型),四色熒光,配套EXPO32采集分析軟件,MultiCycle分析軟件。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞分為7組,正常組:未予H/R及藥物干預(yù)處理;模型組:予 H/R處理;三七總皂苷高劑量組:3.125 1 mg/L;三七總皂苷中劑量組:1.563 1 mg/L;三七總皂苷低劑量組:0.781mg/L;吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)組:PDTC 100 μ mol/L;維拉帕米組:100 μ mol/L維拉帕米;除正常組、模型組外其余5組分別與藥物共同孵育1 h后制作H/R模型。

1.4 H/R模型的制作 將生長至穩(wěn)定狀態(tài)的ECV304細(xì)胞置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱正常培養(yǎng) 1 h,放入 37℃、5%CO2、95%N2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h,取出置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)2 h[2],用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2混合液消化收集各組細(xì)胞。

1.5 氧自由基清除功能測定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按試劑盒操作步驟測定SOD、MDA和GSH。

1.6 內(nèi)皮細(xì)胞 NF-κ B P65表達(dá) 各組 PCAEC爬片,每組 8個(gè)樣本,4%多聚甲醛固定,一抗為NF-κ B P65兔多克隆IgG抗體,稀釋比例為1∶200;余步驟按試劑盒操作步驟進(jìn)行。胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞,每個(gè)樣本任選6個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),陽性率用陽性細(xì)胞數(shù)占同一視野ECV304細(xì)胞數(shù)的百分比表示。每個(gè)樣本的陽性率取不同視野陽性率的平均值。

1.7 內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá) 收集的單個(gè)細(xì)胞,PBS洗兩次,離心去上清,加入CD54-PE單克隆抗體各 10 μ L,室溫孵育30 min后,PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測,其結(jié)果以陽性百分率表示。每份樣本均設(shè)陰性對照(加相應(yīng)IgG抗體),以消除本底熒光的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 SOD活性、MDA及GSH的含量(見表1)正常組細(xì)胞氧自由基清除功能無明顯改變;模型組,tPNS高、中、低濃度組,維拉帕米組及PDTC組細(xì)胞SOD活性、GSH含量明顯低于正常組;MDA的含量明顯高于正常組。tPNS高、中、低濃度組細(xì)胞SOD活性、GSH含量明顯高于H/R組同期,MDA含量明顯低于H/R組,且呈濃度依賴性改變,tPNS高濃度組細(xì)胞SOD活性、GSH含量明顯高于維拉帕米組及PDTC組,MDA的含量明顯低于維拉帕米組及PDTC組。

2.2 NF-κ B、ICAM-1表達(dá)的變化(見表1)正常組細(xì)胞NF-κ B及 ICAM-1表達(dá)無明顯改變;模型組、tPNS高、中、低濃度組、維拉帕米組及PDTC組細(xì)胞NF-κ B及ICAM-1表達(dá)明顯高于正常組,其中 tPNS高、中、低濃度組細(xì)胞NF-κ B及ICAM-1表達(dá)明顯低于H/R組,且呈濃度依賴性改變;tPNS高濃度組細(xì)胞NF-κ B及ICAM-1表達(dá)明顯低于維拉帕米組及PDTC組。

表1 各組ECV304 NF-κ B、ICAM-1表達(dá),SOD、MDA、GSH含量比較(±s)

表1 各組ECV304 NF-κ B、ICAM-1表達(dá),SOD、MDA、GSH含量比較(±s)

組別 SOD(U/mL)MDA(nmol/mL)GSH(mg/L)NF-κ B ICAM-1(%)正常組 11.89±1.58 0.13±0.08 97.73±10.69 3.47±0.92 4.33±0.91 tPNS高劑量組 10.33±2.461) 3.38±0.481) 84.92±8.211) 23.93±7.411) 28.14±2.781)tPNS中劑量組 9.72±1.991) 3.50±0.321) 79.23±8.531) 29.59±5.621) 34.25±4.381)tPNS低劑量組 8.34±1.931) 3.49±0.361) 72.10±6.601) 32.56±3.881) 39.05±4.101)模型組 6.86±3.021) 6.69±0.791) 58.53±4.971) 54.80±5.151) 80.01±2.641)維拉帕米組 9.24±1.791) 3.29±0.531) 79.38±8.641) 24.39±6.471) 34.98±5.001)PDTC組 9.88±2.121) 3.42±0.361) 79.50±9.011) 25.92±5.161) 36.84±4.341)與正常組比較,1)P＜0.05

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液與血管壁之間的屏障,更是重要的內(nèi)分泌器官和效應(yīng)器官,通過釋放和合成多種血管活性因子,在血管自穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在心肌缺血再灌注過程中,由于大量氧自由基的產(chǎn)生,血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活,激活的內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)多種細(xì)胞黏附分子,它引起的急性炎癥反應(yīng)影響內(nèi)皮和心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和代謝[3]。NF-κ B是一系列前炎癥基因激活的共同途徑,對心肌再灌注損傷的發(fā)生起著重要的作用[4]。直接或間接抑制NF-κ B活化均可減輕缺血再灌注損傷[5,6]。

傳統(tǒng)中藥三七主要藥用成分為tPNS,具有散癖止血,消腫定痛功效。歷代醫(yī)家對其藥用價(jià)值都給予了高度評價(jià)。目前認(rèn)為tPNS對抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制主要是:抗氧自由基損傷;抗脂質(zhì)過氧化;抑制鈣通道防止鈣超載;提高心肌SOD活性;增加心肌營養(yǎng)血流量等[7]。三七總皂苷能否減輕缺氧復(fù)氧血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷并不完全清楚。本研究采用ECV304作為研究對象,結(jié)果表明在缺氧-再給氧時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活,細(xì)胞氧自由基清除功能明顯降低,NF-κ B及ICAM-1的表達(dá)升高,用三七總皂苷預(yù)處理后,細(xì)胞氧自由基清除功能明顯改善,NF-κ B的活性明顯被抑制,同時(shí)伴有ICAM-1表達(dá)的下降,且呈濃度依賴性,提示tPNS可有效地抑制 NF-κ B、ICAM-1表達(dá),明顯改善細(xì)胞氧自由基清除功能,減輕缺氧再給氧引起的細(xì)胞損傷。此結(jié)果為進(jìn)一步探討缺血再灌注損傷對心功能造成損害的作用機(jī)制,尋求中醫(yī)藥治療缺血再灌注損傷的新途徑奠定了基礎(chǔ)。

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