王培利,雷 燕,王承龍

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)與血管平滑肌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[1,2],并且PI3K信號(hào)途徑在介導(dǎo)人肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移中起重要作用[3]。低氧可以激活腫瘤細(xì)胞中的PI3K途徑而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡[4]。但在缺血心肌中PI3K表達(dá)如何還未見(jiàn)報(bào)道。Akt又稱蛋白激酶B(proteinkinase B,PKB),是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt是細(xì)胞生存的關(guān)鍵因子。多種生長(zhǎng)因子主要通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。激活后的Akt主要通過(guò)對(duì)含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng),包括抗凋亡、促細(xì)胞生存和增殖功能。同時(shí),PI3K活化后可以直接調(diào)節(jié)促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)途徑,其中包括ERK途徑和JNK途徑。當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有促進(jìn)缺血心肌大鼠血管生成作用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)探討了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)心肌缺血后PI 3K、Akt/PKB、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響,以期明確當(dāng)歸補(bǔ)血湯促進(jìn)血管新生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Folin酚(北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司產(chǎn)品),丙烯酰胺、甘氨酸(Promega),硝酸四氮唑藍(lán)(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP),硝酸纖維素膜(Gelman公司)。蛋白質(zhì)電泳用第二抗體:堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(北京中杉金橋公司)。T ris base、十二烷基硫酸鈉,過(guò)硫酸銨,溴酚藍(lán),胰蛋白酶,乙二胺四乙酸,1 mM苯甲基磺酰氟,0.1%抑蛋白酶肽(Sigma)。PI3K及Akt單克隆抗體試劑盒購(gòu)自北京宣武醫(yī)院多肽實(shí)驗(yàn)室。p38絲裂素活化蛋白激酶活性測(cè)定試劑盒(Cell Signaling)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;

1.2 主要儀器 紫外/可見(jiàn)光光度儀Lamda-Bio(美國(guó)PE公司),電動(dòng)勻漿器 DIAX900(德國(guó)Heidolph公司),轉(zhuǎn)移電泳儀DYY-Ⅲ(北京六一儀器廠),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 DYY-Ⅲ(北京醫(yī)療設(shè)備廠),低溫離心機(jī)Microfuge R(BECKMAN),萬(wàn)向脫色搖床TS-920(北京新技術(shù)應(yīng)用研究所)。Image Pro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng),OLYMPUS生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,許可證:SCX京2000-0006),體重180 g～220 g。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)藥物 當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bunge、當(dāng)歸 Angelica sinensis(Oliv)Diels,均系干品,由中國(guó)中醫(yī)研究院中藥所鑒定為正品。黃芪、當(dāng)歸按5∶1比例合煎,并濃縮至含生藥1 g/mL,4℃保存?zhèn)溆?大、中、小劑量分別為1.2 g/100(g?d)、0.6 g/100(g? d)、0.3 g/100(g?d)。倍他樂(lè)克:阿斯利康制藥有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H32025390,批號(hào)200311002,每只大鼠給藥2.5mg/100(g?d)。

1.3.3 心肌梗死大鼠的制備 采用冠脈結(jié)扎法,術(shù)后腹腔內(nèi)注射青霉素鈉8×105U/d,連續(xù)3 d抗感染。造模成功大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、倍他樂(lè)克組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯大劑量組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯小劑量組。用藥組灌服當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎劑和倍它樂(lè)克水溶液,其他組灌服生理鹽水,均為2周。

1.3.4 免疫組化技術(shù)測(cè)定左室梗死邊緣區(qū)VEGF表達(dá)量 心肌組織切片經(jīng)脫蠟至水 ,3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶 ,枸櫞酸緩沖液熱修復(fù),0.01M PBS緩沖液洗滌 ,山羊血清封閉液封閉,一抗孵育4℃過(guò)夜,0.01M PBS緩沖液洗滌,二抗孵育,0.01M PBS緩沖液洗滌,SABC試劑孵育,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌微血管特異性顯色。采用Image Pro Plus 4.0圖像分析軟件采集數(shù)據(jù),計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域所占總面積。

1.3.5 蛋白定量 兩周后麻醉取材。切下梗死邊緣區(qū);將其置于eppendorf管中加入預(yù)冷的 0.01M PBS液洗滌2次;按照1∶5加入預(yù)冷組織裂解液,Folin酚法定量蛋白;分裝上清,于-70℃保存。

1.3.6 Western免疫印跡方法 應(yīng)用微量加樣器加入25 μ L樣品,第一抗,置于搖床上搖動(dòng),室溫下 2 h。傾去一抗,PBS洗膜3次,每次10 min。加入1∶2 000堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠,置于搖床上,室溫下 2 h。棄去二抗,PBS洗膜3次,每次10 min。加入顯色緩沖液,室溫下染色,觀察到有藍(lán)色條帶出現(xiàn)后,用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)左室梗死邊緣區(qū)VEGF表達(dá)量的影響 模型組的左室梗死邊緣區(qū)VEGF陽(yáng)性面積明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),其他各治療組也有不同程度的升高,而且較模型組更高。其中倍他樂(lè)克組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯小劑量組最為顯著(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖1。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)左室梗死邊緣區(qū)VEGF表達(dá)量和Ⅷ因子血管密度的影響

2.2 PI3K蛋白的表達(dá) 除對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)外,其余各組均有不同程度的PI3K蛋白的表達(dá),其中倍他樂(lè)克組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組表達(dá)最為明顯,而模型組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯大劑量組以及小劑量組表達(dá)較少,條帶灰度最弱。說(shuō)明本缺氧模型具有較弱促進(jìn)PI3K表達(dá)的作用,而倍他樂(lè)克和中藥則可能促進(jìn)PI3K的表達(dá)。詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.3 Akt蛋白的表達(dá) 各組均有不同程度的Akt蛋白表達(dá),其中對(duì)照組最少。模型組也有適量的表達(dá),倍他樂(lè)克組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組較為明顯。缺氧誘導(dǎo)通過(guò)Akt途徑,而藥物也可能通過(guò)該途徑發(fā)揮作用。詳見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組AKT蛋白表達(dá)條帶

圖4 Akt Western印跡信號(hào)強(qiáng)度灰度分析

2.4 p38 MAPK蛋白的表達(dá) 各組均有不同程度的p38 M APK蛋白表達(dá),當(dāng)歸補(bǔ)血湯大劑量組、衰老組以及倍他樂(lè)克組表達(dá)較少。心梗應(yīng)激因素可激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,當(dāng)歸補(bǔ)血湯的作用有劑量差別,隨著劑量增加,激活p38M APK蛋白表達(dá)的作用有所減弱。詳見(jiàn)圖 5、圖6。

3 討 論

血管生成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制同為當(dāng)前兩大熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。近年來(lái)在促血管生成的介導(dǎo)因子及其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等方面的研究取得了重要進(jìn)展。

目前,血管生成研究主要涉及腫瘤和心血管兩個(gè)學(xué)科領(lǐng)域,尤其在腫瘤方面,研究非常深入。腫瘤血管生成致病機(jī)制較為成熟,對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究也較為清晰,其中MAPK家族被認(rèn)為是血管生成信號(hào)通路的重要成員,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化等不同的功能。而在心血管疾病尤其心肌缺血方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制卻鮮有研究,尤其益氣活血中藥改善缺血心肌功能、促進(jìn)血管新生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制更少有報(bào)道。

M APK家族主要分為三個(gè)亞類:ERKl/2、JNK以及p38MAPK。ERKl/2信號(hào)通路被生長(zhǎng)因子活化[7];而JNK通路和p38/HOG-1通路,是由紫外線、滲透壓變化、細(xì)胞因子(IL-1)、TNF和生理應(yīng)激而激活[8],統(tǒng)稱MAPK應(yīng)激信號(hào)通路。以前大量的研究證實(shí) VEGF、FGF、PDGF、EGF等細(xì)胞因子主要通過(guò)絲裂原活化的蛋白激酶信號(hào)途徑介導(dǎo)細(xì)胞增殖。但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的許多生長(zhǎng)因子可通過(guò)PI3K途徑介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖,并且MAPK可作為PI3K下游的靶分子,通過(guò)PI3K/MAPK途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。

PI3K是許多生命活動(dòng)中關(guān)鍵的信號(hào)分子,PI3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)[9,10]。當(dāng)生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合后激活PI3K,磷酸化細(xì)胞膜上肌醇環(huán)中第3位輕基產(chǎn)生3-PIP、3,4-PIP2和3,4,5-PIP3,這些產(chǎn)物可作為第二信使作用于其下游的N與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的蛋白或激酶,如Akt,最終活化和上調(diào)cyclinD1引起細(xì)胞增殖[11,12]。

Akt參與由生長(zhǎng)因子激活的經(jīng)P13K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程日益受到關(guān)注。PKB的表達(dá)可以在缺血區(qū)域誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管,近來(lái)也表明其能夠維持受損心肌組織的完整性,介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[13,14]。

Akt是PI3K下游直接的靶蛋白。PDGF等多種生長(zhǎng)因子都能通過(guò)PDGF受體上酪氨酸(Y740/Y751)位點(diǎn)磷酸化后產(chǎn)生與PI3K的p85亞基結(jié)合的高親和位點(diǎn),誘導(dǎo)PKB的激活。此外,由于PI3K的p110亞基也可直接與小分子GTP酶Ras相互作用,活化的Ras也可通過(guò) PI3K部分激活 PKB。PKB還可通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接作用于核轉(zhuǎn)錄因子CREB,引起特定基因的表達(dá)。PI3K激活的PKB可以介導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子如PDGF、EGF、胰島素、凝血酶 dGF-1及NGF等所誘發(fā)的細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,益氣活血中藥當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠促進(jìn)缺血區(qū)域VEGF的表達(dá);同時(shí)不同程度促進(jìn)PI3K的表達(dá),較模型組與倍他樂(lè)克組具有明顯優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)PI3K的促表達(dá)作用,從而進(jìn)一步啟動(dòng)了下游信號(hào)途徑的激活。倍它樂(lè)克組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組較為明顯促進(jìn)Akt蛋白的表達(dá),模型組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯小劑量組卻明顯激活MAPK蛋白表達(dá)。通過(guò)以上途徑,最終使得缺血區(qū)域心肌的VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng),產(chǎn)生缺血區(qū)域血管生成作用。這表明益氣活血中藥從不同途徑進(jìn)行了抗缺血缺氧及促血管生成的作用。

同時(shí)缺血缺氧也是一個(gè)重要的信號(hào)啟動(dòng)機(jī)制,實(shí)驗(yàn)中顯示其作用較為明顯。已經(jīng)證實(shí)益氣活血藥物具有提高人體免疫力,增強(qiáng)自我修復(fù)能力的作用。本課題組前期研究也表明,益氣活血中藥當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠改善心肌缺血,促進(jìn)血管生成。在缺血缺氧的刺激下,心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞遭受到了破壞,機(jī)體啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制,通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增加、血管增加來(lái)改善損害,但局部而應(yīng)急的反應(yīng)不能挽救大面積的損傷。益氣活血藥物通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,啟動(dòng)生長(zhǎng)、增殖信號(hào),促進(jìn)新生血管生成,增強(qiáng)了機(jī)體抗修復(fù)能力,可望配合應(yīng)對(duì)超過(guò)自我修復(fù)能力的損傷。新的血管生成因子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究不僅是發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)課題,更具有重要的臨床意義,可以說(shuō)人類多數(shù)疾病都與血液循環(huán)和新血管生成有關(guān)。然而,血管生成的促進(jìn)和抑制,是否會(huì)影響腫瘤的消長(zhǎng),同時(shí)又是否影響缺血心肌側(cè)支的成熟,這仍是研究的難點(diǎn)。雖然這些研究還比較淺顯,但進(jìn)展很快,必將為多種疾病的有效治療提供一些新的思路。

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