何 文, 吳蓓蕾, 李 莉, 王錫鋒

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

水稻病毒病是由病毒引起的一類系統(tǒng)性侵染病害,世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的水稻病毒病(包括類菌原體病)約有16種,其中在我國(guó)發(fā)生的有11種(包括兩種類菌原體病),分別是普通矮縮病、黃葉病、條紋葉枯病、黑條矮縮病、黃萎病、草狀矮縮病、簇矮病、鋸齒葉矮縮病、橙葉病、東格魯病、瘤矮病。中國(guó)稻區(qū)廣闊,水稻病毒病可廣泛流行,在病害嚴(yán)重流行時(shí),曾十幾個(gè)省相繼發(fā)病,暴發(fā)成災(zāi),僅一個(gè)省(市、自治區(qū))因病損失稻谷即數(shù)十萬(wàn)t。北方粳稻產(chǎn)區(qū)以水稻條紋葉枯病發(fā)生普遍。

水稻條紋葉枯病(ricestripedisease)是由水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)引起的一種最嚴(yán)重的水稻病毒病害,是通過(guò)灰飛虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]刺吸以持久性方式傳播,汁液、土壤及種子均不能傳毒。自20世紀(jì)80年代末期以來(lái),該病在我國(guó)水稻種植區(qū)的發(fā)病率逐年提高,特別是在粳稻種植區(qū),發(fā)生更為普遍。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全國(guó)近年該病的發(fā)病面積已達(dá)267萬(wàn)hm2以上,病區(qū)發(fā)病率一般在10%～20%,重者株發(fā)病率達(dá)50%～80%,給農(nóng)民帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。

利用水稻品種抗性被認(rèn)為是防治水稻條紋葉枯病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。用常規(guī)方法培育抗病品種存在育種周期長(zhǎng)、效率低,抗病基因與不良性狀連鎖等問(wèn)題。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)所具有的特異性、穩(wěn)定性、高效、快速以及不改變基因組的遺傳組成等特性,為基因功能的研究提供了強(qiáng)有力的手段,同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因植物抗病毒病害增添了新的策略和方法。

1 RNA干擾(RNAi)

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子引起的序列特異性靶基因mRNA降解,從而導(dǎo)致內(nèi)源或外源靶基因沉默的機(jī)制。

1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

盡管RNAi現(xiàn)象只是在20世紀(jì)90年代以來(lái)才被認(rèn)識(shí)并逐漸引起人們的注意,但是第1篇與RNAi相關(guān)的文章可能早在 1928年就已發(fā)表。Wingard[2]發(fā)現(xiàn)由煙草環(huán)斑病毒侵染的煙草植株開(kāi)始時(shí)表現(xiàn)出明顯的病癥,但上部葉片的癥狀會(huì)逐漸變輕,可以從病毒侵染癥狀中“恢復(fù)”過(guò)來(lái),并且新長(zhǎng)出的葉片可抵抗同源病毒的再次侵染,具有了一定的抗性。當(dāng)時(shí)并沒(méi)有有關(guān)RNAi機(jī)制的任何信息,甚至不知道煙草環(huán)斑病毒的基因組是RNA。不過(guò),這一現(xiàn)象說(shuō)明了抗性機(jī)制的存在可以限制或阻止病毒的再次侵染。1998年,Fire等人[3]將dsRNA注入線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)可抑制序列同源基因的表達(dá),抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后,并將此現(xiàn)象稱為RNA干擾。此后,RNA干擾現(xiàn)象被證明廣泛存在于真菌、線蟲(chóng)、果蠅、植物、高等動(dòng)物等生物中,發(fā)現(xiàn)者也因此獲得了2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1.2 RNAi的作用機(jī)制

1.2.1 dsRNA的來(lái)源

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有多種途徑可以產(chǎn)生dsRNA,主要為：1)當(dāng)基因組的一些隨機(jī)位點(diǎn)被插入一段序列的多個(gè)拷貝時(shí),側(cè)翼啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄通讀可以產(chǎn)生與該正義鏈序列互補(bǔ)的雙鏈RNA,形成dsRNA;2)對(duì)于具有末端反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)座子,轉(zhuǎn)錄通讀產(chǎn)生的RNA會(huì)自身回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA(hairpinRNA,hpRNA)[4-5];3)幫助細(xì)胞識(shí)別異常的 RNA(aberrantRNA),并在 RdRP(RNA-dependentRNApolymerase)作用下,轉(zhuǎn)變成dsRNA[6];4)植物中,RNA病毒感染可以直接引入dsRNA[4-5];5)外源基因以反向重復(fù)的形式插入基因組后可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生hpRNA;6)正義RNA大量表達(dá)引起的共抑制,也能誘導(dǎo)dsRNA的產(chǎn)生[7];7)病毒或植物細(xì)胞中的miRNA基因,其前體miRNA(premiRNA)被 DCL1加工為 miRNA-miRNA*雙體(即為dsRNA)[8-9]。無(wú)論哪種途徑產(chǎn)生的dsRNA,都可引發(fā)RNAi。

1.2.2 RdRp介導(dǎo)的補(bǔ)充途徑

在線蟲(chóng)、植物、真菌和果蠅中還存在依賴RNA的RNA聚合酶介導(dǎo)的補(bǔ)充途徑,RdRp可能的作用方式有：1)RdRP以siRNA單鏈為引物合成靶mRNA的互補(bǔ)鏈;2)不需要引物直接合成異常RNA的互補(bǔ)鏈;3)在1條mRNA鏈上結(jié)合了2條或多條siRNA引物,分別由RdRP延伸后再由RNA連接酶連接成互補(bǔ)鏈;4)dsRNA解旋后,2條鏈均結(jié)合上siRNA引物,分別由 RdRP合成互補(bǔ)鏈,新合成的次生dsRNA又被Dicer切割成大量次生siRNA,從而增強(qiáng)了誘導(dǎo)基因沉默的效率[6]。

1.2.3 RNAi的3種主要途徑

通過(guò)大量基因抑制現(xiàn)象的研究,以及生化和遺傳學(xué)上的分析表明,基因沉默有3種不同的途徑。這3種途徑都包括dsRNA被含有RNaseIII結(jié)構(gòu)域的Dicer酶切割為21～26個(gè)核苷酸小分子RNA的過(guò)程[10]。目前研究比較清楚且使用較多的基因沉默小分子RNA主要有siRNA(smallinterfering RNA)及miRNA(microRNA)。

圖1 RNA干擾的機(jī)制(引自諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)委員會(huì))

1.2.3.1 轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)

PTGS是最普遍的一種沉默機(jī)制。此機(jī)制主要由siRNA介導(dǎo)[11]。病毒侵染的植物細(xì)胞中的dsRNA可能是單鏈RNA病毒的復(fù)制中間產(chǎn)物或是其二級(jí)結(jié)構(gòu)形態(tài)。至于植物DNA病毒,其dsRNA可能是具有重疊互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)錄物經(jīng)由退火形成的。在胞質(zhì)中的Dicer酶或其類似物(Dicer-like,DCL)的作用下把長(zhǎng)鏈dsRNA切割成siRNA,其具5′端磷酸和3′端羥基,此外每條單鏈的3′端均有2～3個(gè)突出的非配對(duì)的堿基[12-13]。由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體,即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),然后siRNA作為引導(dǎo)序列,按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA,并引導(dǎo) RISC復(fù)合體結(jié)合mRNA;接著siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位,內(nèi)切核酸酶將mRNA切割成21～23nt的片段,特異性地抑制靶基因的表達(dá);另一方面,釋放的siRNA可結(jié)合在靶mRNA上作為引物,在 RdRp(RNA-dependentRNAPolymerase)的作用下合成 dsRNA,合成的新的dsRNA又可以發(fā)生RNAi現(xiàn)象,特異地降解靶mRNA[14-16],從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(transcriptionalgene silencing,TGS)

TGS機(jī)制是通過(guò)改變靶基因染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。許多研究表明,發(fā)生TGS的主要原因是啟動(dòng)子序列的堿基尤其是胞嘧啶的甲基化。siRNA通過(guò)堿基配對(duì)原理,指導(dǎo) DNA甲基化酶結(jié)合到DNA的特異部位,引發(fā)該部位DNA中胞嘧啶的甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)及組蛋白H3賴氨酸9的甲基化[17-21],使靶啟動(dòng)子失去功能,導(dǎo)致下游基因轉(zhuǎn)錄沉默。另外,DNA甲基化可以阻止轉(zhuǎn)座酶的生成,從而抑制轉(zhuǎn)座子的移動(dòng),保持遺傳穩(wěn)定,防止遺傳損害[22]。

1.2.3.3 翻譯水平的基因沉默

這種機(jī)制主要是由內(nèi)源的miRNA介導(dǎo)的基因沉默。miRNA是由長(zhǎng)度約70nt的RNA形成的莖環(huán)樣前體,經(jīng)Dicer酶作用后形成長(zhǎng)約21～25nt的單鏈RNA,大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對(duì)結(jié)合,它們并不改變miRNA的穩(wěn)定性[23-24]。這種抑制方式最終也通過(guò)形成RISC發(fā)揮作用,結(jié)合在相應(yīng)的 mRNA的3′末端非翻譯區(qū)(3′-UTR)上,對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)調(diào)控,而靶mRNA并不發(fā)生變化,所以屬于一種翻譯水平上的抑制效應(yīng)[25-26]。miRNA和siRNA相同,除了都由Dicer酶加工成熟之外,RNAi必需的Argonaute(alg-1、alg-2)家族基因也是這兩種RNA行使生物功能所必需的。在RNAi過(guò)程中形成的RISC復(fù)合物既含有siRNA又含有miRNA,此復(fù)合物可根據(jù)不同情況產(chǎn)生不同效應(yīng),若siRNA與靶序列不能嚴(yán)格配對(duì)(如有單個(gè)堿基錯(cuò)配),則PTGS無(wú)法進(jìn)行,此時(shí)復(fù)合物轉(zhuǎn)而利用miRNA抑制核糖體在mRNA上延伸從而在翻譯水平阻斷基因表達(dá)[27]。

2 RNAi技術(shù)在植物抗病毒研究中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病毒的防治上。1998年,首次報(bào)道了RNAi技術(shù)在防治馬鈴薯Y病毒病上的應(yīng)用,Waterhouse等人利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段構(gòu)建IRS(inverted repeatsequence)載體進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,使植株完全免疫[28]。

dsRNA為RNAi的誘導(dǎo)起始物。生物體由于病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄以及外源基因?qū)氲仍蚨伎赡墚a(chǎn)生dsRNA分子。dsRNA的產(chǎn)生有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法和轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法。現(xiàn)在普遍采用轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法。

2.1 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 靶基因序列的選擇

構(gòu)建高效的RNAi表達(dá)載體是應(yīng)用RNAi技術(shù)的關(guān)鍵。其中導(dǎo)入的 dsRNA具有特異性是利用RNAi的前提,在保證不影響其他功能的前提下降解病毒基因組。這種特異性是由dsRNA與目的基因的同源序列決定的,所以如果在植物體內(nèi)還有另外的基因與RNAi作用的基因有同源性,這個(gè)基因必定也會(huì)受到 RNAi的影響。另外,對(duì)于 RNAi的作用位點(diǎn)要經(jīng)過(guò)精心選擇。位點(diǎn)選擇不當(dāng)還常常會(huì)導(dǎo)致脫靶效應(yīng)(off-targeteffect)。由于siRNAs和靶mRNA可以有一定的錯(cuò)配和間隙,因此siRNAs可能在一個(gè)基因組中作用于上百個(gè)潛在的目標(biāo)序列[29]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出若干種算法和軟件幫助選擇特異的siRNA靶序列[30],運(yùn)用科學(xué)并相對(duì)先進(jìn)的技術(shù)可以幫助盡量避免脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生。目前,RNAi技術(shù)在植物抗病毒研究中,主要從兩方面來(lái)設(shè)計(jì)RNAi作用的靶位點(diǎn)：1)以病毒基因組序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)dsRNA,來(lái)起到抑制的作用;2)以宿主植物的基因組序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)dsRNA,來(lái)起到抑制的作用。前一種方法目前研究和應(yīng)用的比較多,它是將植物病毒基因組的一部分片段作為RNAi作用的靶位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì) dsRNA,從而達(dá)到抗病毒的目的。Shuichiro[31]等人分別以馬鈴薯X病毒(Potato virusX,PVX)的外殼蛋白基因和TGBp1基因(這個(gè)基因編碼RNA沉默抑制因子)為靶位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)siRNA,他們分別選取了這兩個(gè)基因的部分片段設(shè)計(jì)成可產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列,結(jié)果表明這兩種siRNA都能干擾PVX的侵染。后一種方法研究和應(yīng)用的比較少,因?yàn)樗枰趯?duì)宿主植物某些基因功能了解比較清楚的前提下進(jìn)行。

2.1.2 dsRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)

對(duì)于dsRNA表達(dá)結(jié)構(gòu),人們多采用基因片段反向連接成反向重復(fù)序列的方法,可使表達(dá)的單鏈RNA自我配對(duì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(hpRNA),發(fā)夾莖部形成穩(wěn)定的dsRNA可誘導(dǎo)同源的內(nèi)源基因沉默。通常在片段之間需存在一段間隔區(qū),以便使載體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。而用正義方向連接的內(nèi)含子序列替代hpRNA間隔區(qū),形成帶有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的ihpRNA(intronsplicinghpRNA)載體,其沉默效率可達(dá)到90%以上[32]。Wesley等[33]對(duì)此進(jìn)行了深入的比較研究,其結(jié)果表明長(zhǎng)度為98～853bp的靶基因反向重復(fù)片段能夠高效地導(dǎo)致沉默,其轉(zhuǎn)化體沉默效率可達(dá)66%～100%(平均90%)。另外啟動(dòng)子強(qiáng)弱對(duì)于外源基因的表達(dá)水平也有很重要的影響,在構(gòu)建準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化禾本科植物(如水稻)的表達(dá)載體時(shí),可用Ubiquitin啟動(dòng)子等,以獲得較高的干擾程度[34]。

2.2 RNAi技術(shù)在抗水稻條紋葉枯病毒中的應(yīng)用

利用RNAi技術(shù)賦予植物體病毒抗性具有高度可行性,目前已有通過(guò)RNAi技術(shù)獲得抗性的報(bào)道。如Pinto等[35]將南方菜豆花葉病毒屬的水稻黃斑駁病毒(Riceyellowmottlevirus,RYMV)復(fù)制所需酶的部分基因通過(guò)構(gòu)建載體而轉(zhuǎn)化水稻,誘發(fā)基因沉默,從而使植物具有對(duì)RYMV的抗性,并且這種抗性能穩(wěn)定遺傳3代。馬中良等[36]根據(jù)抗水稻矮縮病毒(Ricedwarfvirus,RDV)序列,構(gòu)建了與其相關(guān)的RNA干擾序列,導(dǎo)入水稻中,發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻矮縮病毒有很高的抗性。

轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白cp基因策略是研究最早、應(yīng)用最廣泛的抗病毒手段。Hayakawa等[37]和燕義唐等[38-39]將條紋葉枯病毒的cp基因分別導(dǎo)入到粳稻和秈稻中,發(fā)現(xiàn)表達(dá)外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì) RSV的侵染起到一定的抗性。研究表明,當(dāng)RSV侵染水稻后,伴隨著病癥的加劇,植物細(xì)胞內(nèi)病毒的外殼蛋白CP和病害特異性蛋白SP發(fā)生積累,而其他病毒蛋白的積累并不明顯,因此推測(cè)這兩種蛋白都是致病相關(guān)蛋白[40]。劉利華等[41]應(yīng)用免疫膠體金電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)病毒的CP和SP在寄主組織細(xì)胞中的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中都有存在,線粒體中沒(méi)有,而細(xì)胞核中只有CP分布,這表明CP極有可能是病害的致病相關(guān)蛋白,甚至致病性方面比SP更為重要;并且還發(fā)現(xiàn)在葉肉組織細(xì)胞壁的胞間連絲中存在CP,據(jù)此推測(cè)CP也可能與病毒的運(yùn)輸有關(guān)。因此,目前在利用RNAi技術(shù)抗水稻條紋葉枯病毒中經(jīng)常選取病毒的cp基因作為靶位點(diǎn)。代玉華等[42]以水稻條紋葉枯病毒的cp基因?yàn)榘袠?biāo),通過(guò)將載體pMCG161和載體pCAMBIA1301雙酶切和連接,構(gòu)建了一個(gè)具有CaMV35S啟動(dòng)子并且在正反義鏈中間含有一個(gè)水稻內(nèi)含子適于水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的高表達(dá)RNAi載體。張恭等[43]利用已公布的水稻條紋葉枯病毒的序列和siRNATargetFinder軟件,獲得了168條siRNA片段,利用這些片段在水稻基因組中BLAST,最終獲得6條與水稻基因組完全不匹配的干擾序列。選擇其中的2條,通過(guò)化學(xué)合成干擾序列,利用pCAMBIA1301質(zhì)粒構(gòu)建了2個(gè)RNA干擾載體。這些研究為探索利用RNA干擾技術(shù)防治水稻條紋葉枯病奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)語(yǔ)

RNAi技術(shù)已經(jīng)高效地應(yīng)用于能夠沉默特定植物基因的分子植物育種,并被Science雜志評(píng)為2001、2002年度自然科學(xué)十大突破之一[44],為目前分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。正如諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)評(píng)獎(jiǎng)委員會(huì)主席戈蘭?漢松說(shuō)：“我們?yōu)橐环N基本機(jī)制的發(fā)現(xiàn)頒獎(jiǎng)。這種機(jī)制已被全世界的發(fā)明家證明是正確的,是給它發(fā)個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)的時(shí)候了?！盧NAi技術(shù)發(fā)展迅速,以上的研究也說(shuō)明RNAi技術(shù)在應(yīng)用于抗水稻病毒研究中的巨大潛力。但RNAi也有其自身的不足之處。研究證實(shí)即使是有一個(gè)堿基的突變,也會(huì)對(duì)干擾的效果產(chǎn)生巨大的影響[45]。siRNA的脫靶效應(yīng)也是進(jìn)行RNAi試驗(yàn)時(shí)需要注意的一個(gè)問(wèn)題[46-47]。并且對(duì)于RSV的各基因產(chǎn)物的功能及其在致病性中的作用等方面的研究還很少。盡管仍有一些問(wèn)題亟待研究,但隨著分子生物學(xué)方法和技術(shù)的發(fā)展,可以預(yù)見(jiàn)上述問(wèn)題必將一一得到解決,有理由相信利用RNAi技術(shù)將在水稻病毒基因功能研究和水稻抗病品種的培育方面發(fā)揮重要作用。

[1]吳書俊,鐘環(huán),左慧,等.水稻抗條紋葉枯病的遺傳與育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(1)：244-248.

[2]Wingard S A.Hosts and symptoms of ring spot,a virus disease of plants[J].Agric Res,1928,37：127-153.

[3]Fire A,Xu S,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391：806-811.

[4]彭昊,王志興,竇道龍,等.由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將葡萄糖氧化酶基因轉(zhuǎn)入水稻[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(1)：16-19.

[5]Plasterk R H.RNA silencing：the genomes immune system[J].Science,2002,296(5571)：1263-1265.

[6]Hutvagner G,Zamore P D.RNAi：nature abhors a doublestrand[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12：225-232.

[7]Beclin C,Boutet S,Waterhouse P,et al.A branched pathway for transgene-induces RNA silencing in plants[J].Curr Biol,2002,12(8)：684-688.

[8]Li J,Yang Z,Yu B,et al.Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis[J].Curr Biol,2005,15(16)：1501-1507.

[9]Park M Y,Wu G,Gonzalez-Sulser A,et al.Nuclear processing and export of microRNA in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(10)：3691-3696.

[10]Baulcombe D.RNA silencing in plants[J].Nature,2004,431：356-363.

[11]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants[J].Science,1999,286：950-952.

[12]Zamore O D.RNA interference：listening to sound of silence[J].Nat Struct Biol,2001,8(9)：749.

[13]Harborth J,Elbashir S M,Becheft K,et al.Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs[J].J Cell Science,2001,114(24)：4557.

[14]Zamore P D,Tuschl T,Sharp P A,et al.RNAi：doublestranded RNA directs the A TP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101：25-33.

[15]Winston W M,Molodowitch C,Craig P H.Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane protein SID-1[J].Science,2002,295(5564)：2456-2459.

[16]Jia S,Noma K,Grewal S I.RNAi-independent heterochromatin nucleation by the stress-activated ATF/CREB family proteins[J].Science,2004,304(25)：1971-1976.

[17]Wassenegger M,Heimes S,Riedel L,et al.RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants[J].Cell 1994,76：567-576.

[18]Mette M F,Aufsatz W,van der Winden J,et al.T ranscriptional silencing and promoter methylation triggered by doublestranded RNA[J].EMBO J,2000,19：5194-5201.

[19]Jones L,Ratcliff F,Baulcombe D C.RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance[J].Curr Biol,2001,11(10)：747-757.

[20]Verdel A,Song tao J,Gerber S,et al.RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the R1TS complex[J].Science,2004,303(30)：672-676.

[21]Buratowski S,M oazed D.Gene regulation：expression and silencing coupled[J].Nature,2005,435：1174-1175.

[22]Zeng Y,Wagner E J,Cullen B R.Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when ex pressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6)：1327-1333.

[23]Volpe T A,Kidner C,Hall I M,et al.Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi[J].Science,2002,297(5588)：1833-1837.

[24]Denli A M,Tops B B,Plasterk R H,et al.Processing of primary micro RNAs by the microprocessor complex[J].Nature,2004,432(7014)：231-235.

[25]Bartel D P.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2)：281-297.

[26]Bernstein E,Caudy A A,Hammond S M,et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature,2001,409(6818)：363-366.

[27]Hannon G J.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894)：244-251.

[28]Waterhouse P M,G raham M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(23)：13959-13964.

[29]M a Y,Creanga A,Lum L,et al.Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens[J].Nature,2006,443(7109)：359-363.

[30]Boese Q,Leake D,Reynolds A,et al.Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design[J].M ethods Enzymol,2005,392：73-96.

[31]Takahashi S,Komatsu K,Kakizawa S,et al.T he efficiency of interference of Potato virus X infection depends on the target gene[J].Virus Research,2006,116：214-217.

[32]Smith N A,Singh S P,Wang M B.Total silencing by intronspliced hairpin RNAs[J].Nature,2000,407(6802)：319-320.

[33]Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A,et al.Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants[J].Plant J,2001,27(6)：581-590.

[34]Chuang C F,Meyerowitz E M.Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana[J].PNAS,2000,97(9)：4985-4990.

[35]Pinto Y M,Kok R A,Bandcombe D C.Resistance to Rice yellow mottle virus(RYMV)incultivated African rice varieties containing RYMV transgenes[J].Nature Biotechnology,1999,17(7)：702-707.

[36]馬中良,楊懷義,王榮,等.利用轉(zhuǎn)hpRNA基因水稻抗水稻矮縮病毒[J].植物學(xué)報(bào),2004,46(3)：332-336.

[37]Hayakawa T,Zhu Y,Itoh K,et al.Genetically engineered rice resistant to Rice stripe virus,an insect-transmitted virus[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89：9865-9869.

[38]燕義唐,王晉芳,邱并生,等.水稻條紋葉枯病毒外殼蛋白基因在工程水稻植株中的表達(dá)[J].植物學(xué)報(bào),1992,34(12)：899-906.

[39]Yan Y T,Wang J F,Qiu B S,et al.Resistance to Rice stripe virus conferred by expression of coat protein in transgenic indica rice plants regenerated from bombarded suspension culture[J].Virologica Sinica,1997,12(3)：260-269.

[40]林奇田,林含新,吳祖建,等.水稻條紋病毒外殼蛋白和病害特異性蛋白在寄主體內(nèi)的積累[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,27(3)：322-326.

[41]劉利華.三種水稻病毒病的細(xì)胞病理學(xué)[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),1999.

[42]代玉華,王錫鋒,李莉,等.一種適合水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的 RNAi載體的構(gòu)建和潮霉素對(duì)水稻轉(zhuǎn)化的影響[J].植物保護(hù),2007,33(2)：37-40.

[43]張恭,劉立峰,周維,等.水稻條紋葉枯病毒 RNA干擾載體的構(gòu)建[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(4)：10-13.

[44]江舸,金由辛.微 RNA—Science雜志2002年十大科技突破第一名[J].生命的化學(xué),2003,23(1)：1-3.

[45]Du Q,Thonberg H,Wang J,et al.A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites[J].Nucleic Acids Res,2005,33(5)：1671-1677.

[46]Saxena S,Jonsson Z O,Dutta A.Small RNAs with imperfect match to endogenous mRN A repress translation.Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells[J].J Biol Chem,2003,278(45)：44312-44319.

[47]Ma H T,On K F,T sang Y H,et al.An inducible sy stem for expression and validation of the specificity of short hairpin RNA in mammalian cells[J].Nucleic Acids Res,2007,35(4)：e22.