尹紅梅，張國民，郭照輝，譚周進，賀月林

（1.湖南省微生物研究所，湖南 長沙410005；2.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南 長沙410128；3.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

發(fā)酵床養(yǎng)豬是利用全新的自然農(nóng)業(yè)理念，結合現(xiàn)代微生物發(fā)酵處理技術而提出的一種環(huán)保、安全、有效的生態(tài)養(yǎng)豬法，它實現(xiàn)了養(yǎng)豬無排放、無污染、無臭氣、并徹底解決了規(guī)模養(yǎng)豬場的環(huán)境污染問題。豬糞中含有豐富的有機質，其中蛋白質的含量又比較高，因而向發(fā)酵床接種產(chǎn)蛋白酶高的發(fā)酵床菌種，能有效地促進有機物降解，加速豬糞腐熟進程，同時還有利于消除致臭物質，減輕對環(huán)境的污染[1]。所以篩選產(chǎn)蛋白酶高的發(fā)酵床菌種，并對其產(chǎn)蛋白酶特性進行研究具有很大的實際意義。筆者采用福林法對6種不同的芽孢桿菌進行產(chǎn)蛋白酶活力測定，并對其產(chǎn)蛋白酶活力高的菌株進行培養(yǎng)基優(yōu)化，旨在研究高產(chǎn)蛋白酶菌種的產(chǎn)酶特性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 （1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15～20 g，水 1 L，pH 7.2。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，淀粉0.3%，豆餅粉1.5%，硫酸錳0.006 2%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，酵母粉1%，蛋白胨0.5%，氯化鐵0.01%，CaCO30.1%，水 1.0 L，pH 7.2。

1.1.2 菌 種 供試菌種為武漢芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，7號芽孢桿菌，9號芽孢桿菌，Y2芽孢桿菌，BB1芽孢桿菌，菌種均由課題組保存。

1.1.3 試 劑 供試試劑為福林試劑[2]，磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），2%酪蛋白溶液，0.4 mol/L三氯乙酸，0.4 mol/L碳酸鈉。

微量元素試劑[3]：FeSO40.5 g，NaCl 0.5 g，Na2MoO4·2H2O 0.5 g，CuCl20.1 g，ZnSO40.5 g，H3BO30.5 g，MnSO41.0 g，去離子水 1.0 L。

1.1.4 儀 器 供試儀器有離心機，UV-1 600紫外分光光度計，水浴鍋，冷凝回流裝置，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 福林法測定蛋白酶活力 （1）繪制標準曲線：配置不同濃度的酪氨酸溶液，用紫外分光光度計測得不同濃度酪氨酸溶液的吸光度，繪制酪氨酸濃度與吸光度的標準曲線，方法參照文獻[2]。（2）蛋白酶活力的測定：對6個樣品菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)，在120 r/min搖床中，30℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h。再各取發(fā)酵培養(yǎng)液5 mL進行離心，2 000 r/min離心20 min，取上清粗酶液。取6支試管，分別編號，每支試管加入相應酶液1 mL，置于40℃水浴預熱2 min，再分別加入同樣經(jīng)預熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min。再分別加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，以終止反應，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，殘余蛋白質沉淀后離心。另取6支試管，分別編號，每支試管內(nèi)加入離心上清液1 mL，再加0.4 mol/L碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻。40℃保溫發(fā)色20 min后進行吸光度測定，每組測3次，取平均值。每支試管各設一個空白試驗，即在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白，測定方法同上。（3）蛋白酶活計算：以在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為一個蛋白酶活力單位。蛋白酶活力計算公式為：

A：由樣品測得OD值，查標準曲線得相應的酪氨酸微克數(shù)；4：4毫升反應液取出1mL測定；N：酶液稀釋倍數(shù)；10：反應10 min。

1.2.2 高產(chǎn)蛋白酶菌種培養(yǎng)基優(yōu)化 對于產(chǎn)蛋白酶效果好的菌種，在其培養(yǎng)基中加入微量元素，使微量元素溶液在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.4%，然后同樣用上述方法測定蛋白酶活力，并比較加入微量元素前后菌種產(chǎn)蛋白酶活力大小的變化。

2 結果與分析

2.1 不同菌種產(chǎn)蛋白酶活力隨時間的變化

不同芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力隨時間的變化見表1。由表1可以看出：7號芽孢桿菌、9號芽孢桿菌和Y2芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的活力很小，發(fā)酵24 h后分別為256 U、438 U和248 U，而武漢芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和BB1芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的活力相對較大，發(fā)酵24 h后分別為2 567 U、601 U和1 630 U。同時，發(fā)酵48 h之后測定菌種的蛋白酶活力比發(fā)酵24 h的大，以枯草芽孢桿菌表現(xiàn)更突出。

表1 不同芽孢桿菌發(fā)酵24、48 h的蛋白酶活力

2.2 微量元素對菌種產(chǎn)酶的影響

微量元素對三種高產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌的影響見表2，從表2可以看出，在加入微量元素后，武漢芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶的活力明顯增大，發(fā)酵24 h后測定的蛋白酶活力由原來的499 U增大到4 081 U，而發(fā)酵48 h后測定的蛋白酶活力則由原來的5 456 U增大到6 808 U。而微量元素的加入對其他2個菌種產(chǎn)蛋白酶的活力并沒有明顯的影響。

表2 微量元素對芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響（發(fā)酵24、28 h）

3 分析與討論

芽孢桿菌是一類具有內(nèi)生芽孢，繁殖能力強，且在自然界中廣泛存在的非致病細菌。近年來國內(nèi)外對于芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌活性物質的研究比較多，但是對于其產(chǎn)蛋白酶的研究相對較少[4-5]。

采用福林法對6種芽孢桿菌進行發(fā)酵后產(chǎn)蛋白酶活力測定。實驗結果表明，6種芽孢桿菌均有產(chǎn)蛋白酶能力，且在發(fā)酵48 h后蛋白酶的產(chǎn)量都比發(fā)酵24 h后的要多。其中，武漢芽孢桿菌具有最高的產(chǎn)蛋白酶能力，枯草芽孢桿菌和BB1的產(chǎn)量其次，另外的Y2、7號、9號菌種的產(chǎn)蛋白酶量很小，不具有實際的生產(chǎn)意義，所以在優(yōu)化實驗中沒有進行測定。第2次在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入微量元素溶液后，武漢芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶量明顯增大，且在發(fā)酵24 h內(nèi)蛋白酶活力增加更為明顯，推測是Zn2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+等金屬離子的加入，可以作為武漢芽孢桿菌某些蛋白酶的輔基，從而促進了某些蛋白酶的合成。而枯草芽孢桿菌和BB1芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶量沒有很大的變化，即微量元素對其產(chǎn)蛋白酶沒有促進作用。所以，在實際生產(chǎn)中可以對武漢芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶進行微量元素的優(yōu)化。

[1] 謝金防，熊文華，劉林秀，等.對發(fā)酵床養(yǎng)豬技術的認識與思考[J].豬業(yè)科學，2008，（9）：46-47.

[2] 陸文清，李德發(fā)，任繼平.福林顯色法測定飼料用蛋白酶活力的要點分析[J].飼料研究，2003，（9）：29-30.

[3] 郭成栓，謝 和.枯草芽孢桿菌B1⑥菌株產(chǎn)蛋白酶液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].山地生物學報，2006，25（6）：554-557.

[4] 權春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究 [J].微生物學報，2006，46（1）：7-12.

[5] Kim P I,Chung K C.Production of an antifungal protein for control of Colletotrichttm lagemtrium by Bacillus amyloliquefacicns MET0908.FEMS[J].Microbiology letters,2004，234 （1）：l77-183.