何業(yè)華，吳會桃，羅吉，方少秋，馬均，盧敏，彭兵，伍成厚

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝植物生物技術(shù)研究所，廣東 廣州 510642)

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)基因是生物體內(nèi)的重要代謝基因，它們在生物與環(huán)境之間起著重要的聯(lián)系作用，被認(rèn)為是環(huán)境基因的典型代表[1].CYP1A1是 P450基因大家族的成員之一，它存在于哺乳動物的肝臟等組織內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物CYP1A1能催化一系列的多環(huán)芳香碳?xì)浠衔?，如苯巴?benzopyrene)和 3-甲基膽蒽(3-methylchol-anthene)等，生成環(huán)氧化合物而解除毒性，也能被平面多環(huán)芳香化合物TCDD、二噁咽等誘導(dǎo)，因此，含有CYP1A1的轉(zhuǎn)基因植物可用于監(jiān)測或降解環(huán)境中難分解性有機(jī)污染物質(zhì)(persistent organic pollutants，簡稱POPs)[1].菠蘿又稱鳳梨(Ananas comosus)，是世界三大熱帶果樹之一，也是重要的觀賞植物和纖維植物，耐干旱瘠薄，生長迅速，因此，將 CYP1A1導(dǎo)入菠蘿中可培育出具有環(huán)境凈化功能的新型果樹和觀賞植物.雖有研究者進(jìn)行過菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化研究[2-3]，但迄今尚未見P450基因轉(zhuǎn)化菠蘿等果樹的研究報道.筆者以菠蘿愈傷組織為受體，開展了CYP1A1轉(zhuǎn)化菠蘿的研究，獲得了轉(zhuǎn)CYP1A1的轉(zhuǎn)基因菠蘿植株，旨在以該基因提高菠蘿對本身及土壤中殘留農(nóng)藥等POPs的降解能力.

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菠蘿品種為神灣(Ananas comosus cv.Shenwan)，采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果園，取吸芽作為外植體.

含有人類 CYP1A1的植物表達(dá)重組質(zhì)粒(pUHA1-CYP1A1)和大腸桿菌重組質(zhì)粒(pUHA1-CYP1A1)分別保存在根癌農(nóng)桿菌(LBA4404菌株)和大腸桿菌(JM109菌株)中，－70 ℃貯存.質(zhì)粒、農(nóng)桿菌菌株和大腸桿菌菌株均由日本神戶大學(xué)基因研究中心(Research Center for Environmental Genomics，Kobe University)贈送.

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)

按照何業(yè)華等[4]的方法，取菠蘿吸芽在MS+2.0 mg/L BA+3.0 mg/L NAA 上誘導(dǎo)愈傷組織， 切下該愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基 MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA 上增殖.培養(yǎng)條件為：溫度(26±2)℃，每天光照14 h，光照度2 000～3 000 lx.

1.2.2 植株轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化方法主要參照文獻(xiàn)[5].劃線培養(yǎng)含有pUHA1-CYP1A1的根癌農(nóng)桿菌 LBA4404，挑選單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)過夜，將其菌液稀釋至D600nm為0.5 左右.將受體愈傷組織切分成0.5 mm大小，在MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA上預(yù)培養(yǎng)2 d.將愈傷組織在農(nóng)桿菌菌液中浸泡5 min，以無菌濾紙迅速吸干受體材料上多余的菌液，植于 MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+100 μmol/L AS (acetosyringone，乙酰丁香酮)上于黑暗中共培養(yǎng) 3 d，然后轉(zhuǎn)入 MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+20 mg/L Km+400 mg/L Carb上進(jìn)行選擇分化培養(yǎng)(每天光照時間16 h，光照度2 000 lx ).約28 d 后，將抗卡那霉素(Km)的綠色不定芽切下，轉(zhuǎn)接在 MS+2.0 mg/L NAA+30 mg/L Km+300 mg/L Carb上選擇2 代.將綠芽轉(zhuǎn)入MS+1.0 mg/L IBA+30 mg/L Km上生根成苗.每批次浸泡處理約500塊左右愈傷組織，連續(xù)3次進(jìn)行選擇培養(yǎng).

選擇率=(綠芽數(shù)/本輪選擇不定芽總數(shù))×100%.

累積選擇率=(本輪選擇所得綠芽數(shù)/初代選擇時的不定芽總數(shù))×100%.

1.2.3 抗性植株的分子檢測

分別取0.2 g轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株葉片，采用CTAB法提取DNA.根據(jù)CYP1A1中一段長約400 bp序列設(shè)計 1對特異引物.上游引物 P1：5′-GCCAAGCTTTATAACAATGC-3′；下游引物 P2：5′-AAGGACATGCTCTGACCATT-3′(由上海生物工程公司合成).25 μL PCR反應(yīng)體系包括2 μmoL/L的引物 P1和引物 P2各 2.5 μL，10×Buffer(with MgCl2)2.5 μL，10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，0.7 U Taq酶.反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行38個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

按上述步驟進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出的片段經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜，用重組質(zhì)粒(pUHA1-CYP1A1 )PCR 產(chǎn)物回收的CYP1A1片段，按DIG DNA Labeling and Detection Kit使用說明制備探針.根據(jù)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行Southern雜交驗證.

2 結(jié)果與分析

2.1 Km對菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響

菠蘿對 Km比較敏感，但也具一定的耐受能力.將愈傷組織接種在含不同質(zhì)量濃度Km的分化培養(yǎng)基(以瓊脂為凝固劑)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中 Km質(zhì)量濃度在10 mg/L時，分化出的不定芽中白化芽只占27.6%，仍有72.4%的不定芽顯現(xiàn)綠色；但當(dāng)Km質(zhì)量濃度升高到15 mg/L時，分化出的不定芽已全部都是白化芽(圖1，表1).

圖1 Km對菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響Fig.1 Influence of Km on adventitious shoots differentiation of pineapple callus

表1 Km對菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響Table 1 Influence of Km on adventitious shoots differentiation of pineapple callus

Km對愈傷組織不定芽分化的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而加大，當(dāng)Km質(zhì)量濃度為50 mg/L時不定芽分化已基本被抑制(表1).為了保證較高的分化率和減少假陽性植株，增強(qiáng)選擇培養(yǎng)時的篩選效果，將初次選擇轉(zhuǎn)化體時的Km質(zhì)量濃度確定為20 mg/L；從第2輪開始，隨著轉(zhuǎn)化芽的長大，將選擇培養(yǎng)基中Km質(zhì)量濃度加大至30～50 mg/L.試驗中還發(fā)現(xiàn)，菠蘿不定芽對Km的耐受性隨培養(yǎng)基凝固劑的不同而異，在成分相同的培養(yǎng)基中，用卡拉膠作培養(yǎng)基凝固劑時，即使Km質(zhì)量濃度達(dá)50 mg/L，愈傷組織所分化的不定芽也都生長正常，綠芽率達(dá)100%，Km發(fā)揮不出選擇作用(表1).

2.2 轉(zhuǎn)化植株的獲得

分4批轉(zhuǎn)化了2 090塊愈傷組織，經(jīng)過連續(xù)3輪的選擇，獲得了97株抗Km植株(圖2).由表2不同批次轉(zhuǎn)化體的選擇情況可知，不同批次間的轉(zhuǎn)化率差異比較大，第3輪選擇后的最終轉(zhuǎn)化率(累積選擇率)為 0.12%～2.69%，表現(xiàn)出較大的隨機(jī)性(圖2-a、圖 2-b).

圖2 CYP1A1菠蘿轉(zhuǎn)化體的選擇Fig.2 Selection of pineapple CYP1A1 transformants

表2 不同批次的轉(zhuǎn)化體選擇情況Table 2 Transformants selection of different groups

第1輪選擇培養(yǎng)時，不定芽分化系數(shù)一般在3以上，不定芽高1～5 mm，具2～5枚肉眼可辨別的葉片，綠芽(Km抗性芽)率 0.75%～17.41%，其Km抗性芽率差異極顯著.一些較大的不定芽(高度 4 mm 以上)中綠芽所占比例較高，較小的不定芽(高度2 mm以下)綠芽數(shù)極少，這可能是較大的不定芽在農(nóng)桿菌侵染之前就已形成芽原基，對Km抗性較強(qiáng)，并非真正的轉(zhuǎn)化芽，而較小的不定芽是農(nóng)桿菌侵染之后2～3周形成的，所以，綠芽數(shù)少.為消除侵染時受體材料造成的這種誤差，在第 2、3輪選擇培養(yǎng)繼代時采取了如下3項措施：一是將第1輪選擇得到的綠芽葉全部切除，只保留莖尖，使其在選擇過程中重新萌發(fā)新葉；其次是使用不定芽生長培養(yǎng)基(不含BA)，防止不定芽繼續(xù)分化，以減少分化對選擇過程的干擾；第三是提高Km質(zhì)量濃度至30 mg/L，以加大選擇壓力.這樣，在第2輪選擇培養(yǎng)結(jié)束后，第1輪中的大部分假陽性植株因還原為白色植株而被清除掉，淘汰率 63%～78%；第 3輪選擇時選擇率已在50%以上，此時各批次之間的差異已不顯著.

第3輪選擇培養(yǎng)結(jié)束后，將抗性芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)至植株具 8枚以上長度約 3 cm的葉、5條以上長度大于1 cm的根時，即可進(jìn)行煉苗移栽.移栽后轉(zhuǎn)化苗能正常生長(圖2-c)，但不同植株之間長勢差異較大.

2.3 Km抗性植株的分子檢測

分別從7個獨(dú)立轉(zhuǎn)化批次中隨機(jī)抽取2株Km抗性植株，用CYP1A1特異引物對其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所取的14 株Km抗性中有9株擴(kuò)增出了目的片段，分別是圖3-a中的第1、2、3、5、6、9、11、13、14號株，PCR陽性率達(dá)64.29%.對6株P(guān)CR陽性植株進(jìn)行了Southern雜交分析，結(jié)果表明，其中只有1株(4號)與野生型植株(陰性對照)一樣無雜交信號，為假陽性植株，其他5株(1、2、3、5、6號)PCR陽性植株獲得了與重組質(zhì)粒(陽性對照)大小相同的雜交信號，表明為轉(zhuǎn)基因植株（圖3-b).

圖3 CYP1A1菠蘿轉(zhuǎn)化體的分子生物學(xué)鑒定Fig.3 Detection in molecular biology of pineapple CYP1A1 transformants

3 結(jié)論與討論

將預(yù)培養(yǎng)2 d后菠蘿愈傷組織經(jīng)含植物表達(dá)重組質(zhì)粒(pUHA1-CYP1A1)的根癌農(nóng)桿菌(LBA4404菌株)侵染后，在含有100 μmol/L AS的瓊脂上共培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+20 mg/L Km+400 mg/L Carb+8 g/L agar)上選擇培養(yǎng)；將得到的綠色不定芽轉(zhuǎn)入 MS+2.0 mg/L NAA+30 mg/L Km+300 mg/L Carb+8 g/L agar上再進(jìn)行連續(xù)2輪選擇，除去其中的假抗性芽；最后將綠芽轉(zhuǎn)入 MS+1.0 mg/L IBA+30 mg/L Km+8 g/L agar上生根，共獲得95株Km抗性植株，最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)2.69%.對其中部分抗Km植株進(jìn)行PCR檢測，PCR陽性植株率達(dá)64.29%.經(jīng) Southern雜交，進(jìn)一步證實(shí) CYP1A1基因已整合到菠蘿基因中.以瓊脂為培養(yǎng)基凝固劑、共培養(yǎng)基中添加AS、增加選擇次數(shù)和逐漸增加新一輪選擇培養(yǎng)基中的Km質(zhì)量濃度等是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)菠蘿愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株的重要條件.

npt-Ⅱ是植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的選擇標(biāo)記基因，其表達(dá)產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT-Ⅱ)通過酶促磷酸化使氨基葡萄糖苷類抗生素失活，因而含有npt-Ⅱ的轉(zhuǎn)基因植株具有抗Km或新霉素等氨基葡萄糖苷類抗生素能力，但通常認(rèn)為npt-Ⅱ?qū)Χ箍浦参锖蛦巫尤~植物的轉(zhuǎn)化選擇效果不佳[7].有學(xué)者認(rèn)為npt-Ⅱ是菠蘿適宜的選擇標(biāo)記基因，但Km不是合適的篩選抗生素[8].本研究結(jié)果表明，在以瓊脂作凝固劑時，菠蘿對Km敏感，愈傷組織在含有15 mg/L Km的分化培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不定芽全部白化，當(dāng)Km質(zhì)量濃度超過50 mg/L時很難分化出不定芽；用卡拉膠作為凝固劑時，50 mg/L Km還不會出現(xiàn)白化苗，甚至100 mg/L Km也只有約20%不定芽白化.其原因可能是卡拉膠中某些組分固定或破壞了Km，使其毒性大為降低.另外，因?qū)m耐受能力與芽體大小成正比，從第2輪選擇開始應(yīng)提高培養(yǎng)基中Km的濃度.

菠蘿愈傷組織一旦轉(zhuǎn)入不定芽選擇分化培養(yǎng)基中，便會不斷分化產(chǎn)生不定芽而嚴(yán)重干擾Km抗性芽的選擇過程，因此，在選擇培養(yǎng)繼代過程中，應(yīng)仔細(xì)挑選抗 Km的綠芽，并除去其基部愈傷組織.另外，在抗性芽增殖過程中發(fā)現(xiàn)，在所增殖出的新不定芽中，仍有較高比例的白化芽(非抗性芽)產(chǎn)生，這表明以愈傷組織為轉(zhuǎn)基因受體，經(jīng)器官發(fā)生途經(jīng)所得到的轉(zhuǎn)化植株可能是由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)基因嵌合體植株，因此，筆者擬對以胚性細(xì)胞為受體，經(jīng)體細(xì)胞胚再生途徑獲得均質(zhì)轉(zhuǎn)基因植株的可能性進(jìn)行研究.

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