彭南妮，薛立群，鄧治邦，梁苑燕，袁安文*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518000)

卵巢移植技術(shù)與動(dòng)物輔助生殖技術(shù)相結(jié)合，已在動(dòng)物繁殖和擴(kuò)大瀕危動(dòng)物種群方面顯示了特殊的應(yīng)用價(jià)值，被認(rèn)為是延續(xù)和保存雌性生殖能力的一種有效方法[1-3].伴隨著卵巢同體、異體和異種移植，卵巢異性移植也獲得新的突破.2004年Waterhouse等[4]從移植到雄性受體小鼠的卵巢移植體采集卵母細(xì)胞，經(jīng)體外受精獲得小鼠后代.已有研究[3-4]證實(shí)，移植卵巢在雄性動(dòng)物受體中具有與雌性受體相似的卵泡發(fā)育能力，且可以由出生時(shí)的幼稚型卵巢完成生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[5]，并對(duì)外源促性腺激素刺激卵泡發(fā)育作用產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)[6].2006年Yang等[7]通過(guò)體外培養(yǎng)試驗(yàn)證明，雄性激素可以刺激牛卵巢組織的初級(jí)卵泡發(fā)育成次級(jí)卵泡.然而，在睪丸、卵巢并存的卵巢異性移植受體中，精子的發(fā)生及成熟是否受移植卵巢的影響仍有待確認(rèn).為此，筆者對(duì)卵巢移植雄性受體精子質(zhì)量及生殖能力進(jìn)行了觀測(cè)，探討卵巢移植體對(duì)受體精子發(fā)育及生殖能力的影響，旨在為發(fā)展初生期卵巢異性異位移植技術(shù)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部.自繁 1日齡雌鼠作為卵巢供體，10～12周齡雄鼠作為卵巢移植受體.供試小鼠在自然光照、22～25 ℃下飼養(yǎng)，自由飲水、采食.

1.1.2 主要試劑與儀器

Leibovitz 15(L15)(Invitrogen公司)；新生牛血清(NBS)(北京鼎國(guó)生物科技有限公司)；L15*(L15＋10% NBS＋100 IU/mL青霉素＋100 IU/mL鏈霉素).

體視顯微鏡(Motic，SMZ-168)；顯微照相系統(tǒng)(Motic，Moticam 350)；潔凈工作臺(tái)(凈集團(tuán)安泰公司，VS-1300L-U)；倒置顯微鏡(Leica，DMIL)；生物顯微鏡(Motic，BA200)；石蠟切片機(jī)(SAKURA，SRM 200 CW).

1.2 方 法

1.2.1 供體卵巢采集

參照袁安文等[8]的方法，將1日齡供體雌鼠斷頸處死，體表用75%酒精消毒，用眼科鑷撕開腹腔，在體視顯微鏡下摘取卵巢部分，放入L15*液中，去掉卵巢周圍的包膜，放入L15*液中備用，在0.5 h內(nèi)移植到受體鼠.

1.2.2 腎囊下卵巢移植

腎囊下卵巢移植參照袁安文等[8]的方法，對(duì)受體雄鼠稱重，用1%戊巴比妥鈉按10 g體重0.1 mL進(jìn)行全身麻醉，背部剪毛，用75%酒精消毒；沿背中線剪開皮膚，在腹壁剪1小口，暴露左腎臟，用一銳利鑷在腎囊上撕開1個(gè)小口，用自制玻璃吸管吸住卵巢送入腎囊下，移植卵巢 2～3枚，還納腎臟，縫合切口.

1.2.3 卵巢移植體回收及卵母細(xì)胞的采集

卵巢移植分為A、B兩組，以移植當(dāng)天記為0天，分別于移植后第21天(A組)、第28天(B組)斷頸處死受體小鼠，取出卵巢移植腎，分離卵巢移植體，放入L15*液中，在體視顯微鏡下用4號(hào)針頭刺破有腔卵泡，釋放出卵母細(xì)胞，記錄每個(gè)受體回收卵母細(xì)胞數(shù)，在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察與照相.

1.2.4 受體精子的采集與精子畸形率的測(cè)定

A、B兩組受體小鼠在回收卵巢移植體后取其睪丸、附睪，在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察并照相.取一側(cè)附睪尾放入L15*液中，輕輕擠壓, 釋放精子，用100倍倒置顯微鏡觀察精子活動(dòng)情況，取擴(kuò)散后的精液涂片.將一側(cè)睪丸、附睪放入10%中性福爾馬林液中固定.以同齡的正常雄鼠為對(duì)照組(C組)，操作同上.

精子畸形率的測(cè)定方法：精液涂片干燥后，用95%的乙醇固定3 min，龍膽紫染液染色5 min，用蒸餾水洗凈，干燥后每只鼠隨機(jī)鏡檢不同視野的精子300～500個(gè)，計(jì)數(shù)畸形精子，計(jì)算畸形精子的百分率.畸形精子的計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[9]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，包括精子的頭部畸形、頸部畸形、尾部中段畸形、尾部主段畸形以及未成熟精子.

1.2.5 睪丸組織學(xué)檢查

睪丸、附睪組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋后切片，切片厚度為5 μm，HE染色，對(duì)切片進(jìn)行觀察與顯微照相.

1.2.6 雄鼠受體配種試驗(yàn)

將卵巢移植后 21～35 d的雄性受體與成年雌鼠合籠，常規(guī)飼養(yǎng)，記錄雌鼠窩產(chǎn)活仔數(shù)，以評(píng)價(jià)其繁殖能力，以同齡的正常雄鼠與成年雌鼠合籠組作為對(duì)照.于移植后第 35天斷頸處死受體小鼠，觀察卵巢移植體生長(zhǎng)發(fā)育狀況.

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS.V9.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢移植體和卵母細(xì)胞的觀察與回收結(jié)果

A、B兩組移植體均生長(zhǎng)、增大，呈圓形或腎形凸起，表面可見(jiàn)有網(wǎng)狀血管分布(封二圖1-A).從腎囊下剝離出來(lái)的移植體在體視顯微鏡下可見(jiàn)有半透明泡狀結(jié)構(gòu)(封二圖1-B)，此為有腔卵泡.用針刺破有腔卵泡可獲得卵母細(xì)胞(封二圖1-C)，其形態(tài)正常，生發(fā)泡明顯.回收卵母細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表 1.經(jīng) t檢驗(yàn)，A、B組間差異不顯著(P＞0.05).

表1 回收卵母細(xì)胞數(shù)與精子畸形率Table 1 Number of recovered oocytes and rates of abnormal sperms

2.2 睪丸、附睪組織形態(tài)觀察與精子畸形率測(cè)定

卵巢移植受體睪丸、附睪形態(tài)正常(封二圖1-D)，與對(duì)照雄鼠相比無(wú)可見(jiàn)異常.鏡下可見(jiàn)附睪尾管腔內(nèi)充滿精子，分離精子大多數(shù)呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)，絕大多數(shù)精子形態(tài)正常(封二圖1-E)，精子畸形率見(jiàn)表 1.經(jīng) F檢驗(yàn)，組間差異不顯著(P＞0.05)，但卵巢移植組精子畸形率有增高的趨勢(shì).組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，卵巢移植受體睪丸曲精小管形態(tài)正常，管腔內(nèi)有精子(封二圖 1-F)，附睪頭(封二圖 1-G)、附睪尾(封二圖1-H)管腔內(nèi)充滿精子，形態(tài)學(xué)上與對(duì)照雄鼠的睪丸(封二圖 1-I)、附睪頭(封二圖 1-J)和附睪尾(封二圖1-K)沒(méi)有明顯的不同.

2.3 卵巢移植對(duì)受體繁殖力的影響

移植35 d后，受體腎囊下有卵巢移植體(封二圖1-L).卵巢移植受體、正常對(duì)照雄鼠與雌鼠合籠產(chǎn)仔情況見(jiàn)表 2.受體配種的雌鼠平均窩產(chǎn)活仔數(shù)比對(duì)照雄鼠的低，經(jīng) t檢驗(yàn)，兩組間差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明卵巢移植受體有正常的繁殖能力.所產(chǎn)仔鼠外觀形態(tài)正常，無(wú)畸形.

表2 卵巢移植對(duì)受體繁殖力的影響Table 2 Effects of ovarian transplantation on reproduction of the recipients

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在雌、雄性腺同體的卵巢異性移植受體中，新生鼠卵巢移植體的生長(zhǎng)及卵泡發(fā)育未對(duì)雄性受體的精子發(fā)生與成熟產(chǎn)生明顯影響.雄性受體的精子畸形率、睪丸形態(tài)、附睪管組織結(jié)構(gòu)以及與雌鼠配種的窩產(chǎn)活仔數(shù)均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05).盡管目前尚未見(jiàn)到與此相關(guān)的研究報(bào)道，但本試驗(yàn)結(jié)果可以初步證實(shí)卵巢異性移植不會(huì)明顯地影響雄性受體自身的生殖機(jī)能.

精子的生成和成熟是復(fù)雜的生理過(guò)程，受內(nèi)分泌相關(guān)激素調(diào)節(jié)[10].有研究表明，大劑量的雌激素可引起成年動(dòng)物睪丸發(fā)生異常和生精障礙，而體外條件下小劑量的雌激素又能誘導(dǎo)精子發(fā)生和成熟，減少細(xì)胞凋亡[11].然而，本試驗(yàn)中卵巢移植體的生長(zhǎng)及卵泡發(fā)育未對(duì)雄性移植受體精子的生成及成熟產(chǎn)生明顯影響，雄性受體精子的形態(tài)、精子畸形率及配種的產(chǎn)仔率均保持在與對(duì)照組相近水平，無(wú)顯著差異.內(nèi)源性雌激素對(duì)精子成熟和睪丸功能的影響取決于組織局部的雌激素水平[12]，芳香化酶抑制劑或抗雌激素抗體的處理可以減少精子生成的數(shù)量和影響精子的成熟[13].由此筆者推論，在通過(guò)卵巢異性移植構(gòu)建的雌、雄性腺同體的雄性受體中，卵巢移植體并未對(duì)調(diào)節(jié)精子生成及成熟的下丘腦─垂體─睪丸系統(tǒng)產(chǎn)生明顯干擾作用，也說(shuō)明卵巢移植體產(chǎn)生的生理劑量雌激素對(duì)雄性受體的生殖機(jī)能無(wú)顯著不利影響.

此外，本試驗(yàn)中卵巢移植體的生長(zhǎng)及卵泡發(fā)育與前期的研究報(bào)道[5]相一致，也進(jìn)一步證實(shí)雄性受體可以為滿足新生鼠幼稚型卵巢的生長(zhǎng)、卵母細(xì)胞及有腔卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育提供基本的生理環(huán)境保障.在這種卵巢異性移植構(gòu)建的雌、雄性腺同體個(gè)體中，兩性的生殖細(xì)胞卵子和精子均可得到良好發(fā)育的有趣現(xiàn)象，說(shuō)明生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育可能在兩性生殖模式動(dòng)物中沒(méi)有嚴(yán)格的性別生理環(huán)境的要求.

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