鐘蕾，肖克宇*，戴良英

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸炎病、爛鰓病是對(duì)草魚危害最大的細(xì)菌性疾病，目前主要依賴抗菌類藥物進(jìn)行治療.爛鰓病菌苗和多聯(lián)佐劑疫苗對(duì)草魚腸炎病、爛鰓病的防治效果較好，但存在效果不穩(wěn)定和制造成本高等問題.將微生物原生質(zhì)體融合方法應(yīng)用于動(dòng)物致病微生物方面的研究[1-4]較多，這為發(fā)展細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)，研制細(xì)菌多聯(lián)弱毒菌苗探索出了一條新的途徑.筆者采用原生質(zhì)體融合技術(shù)將草魚爛鰓病和腸炎病的病原菌進(jìn)行融合，選育遺傳性穩(wěn)定的融合子，旨在為制備病原菌融合疫苗提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

(1)供試菌種.腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌 58-20-9菌株，魚害粘球菌 G4菌株，均由中國科學(xué)院水生生物研究所提供.

(2)培養(yǎng)基.完全培養(yǎng)基：蛋白胨 11%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.5%，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min (固體培養(yǎng)基加瓊脂2%).再生培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L甘露醇，0.02 mol/L六水氯化鎂，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH值 6.7，115 ℃滅菌 20 min (固體培養(yǎng)基加瓊脂2%).雙抗選擇培養(yǎng)基：在再生培養(yǎng)基中加入慶大霉素3 000 IU/mL和紅霉素50 IU/mL.

(3)主要試劑.EDTA溶液：0.1 mol/L乙二胺四乙酸鈉，pH值8.0.SMM緩沖溶液：蔗糖0.5 mol/L，MgCl20.02 mol/L，順丁烯二酸0.02 mol/L，pH值7.5，121 ℃滅菌20 min后備用.SMMD溶液：SMM緩沖液中加DNA酶5 μg/mL，即配即用.PEG溶液：在SMMD高滲液中加入40%的PEG6000，pH值7.0.新生磷酸鈣溶液：K2HPO40.54 g，CaCl2H2O 29.4 g分別溶于100 mL水中，滅菌，使用時(shí)等體積混合，促進(jìn)原生質(zhì)體的融合.高滲美藍(lán)染液：0.5 g美藍(lán)溶解于100 mL 0.5 mol/L的蔗糖溶液中.

1.2 方 法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

將原始菌種接種至斜面完全培養(yǎng)基，活化后立即轉(zhuǎn)接至30 mL液體完全培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h備用.

1.2.2 耐藥性遺傳標(biāo)記選擇及耐藥菌株培育與穩(wěn)定

耐藥性遺傳標(biāo)記的選擇參見文獻(xiàn)[5].耐藥菌株的進(jìn)一步培育與穩(wěn)定采用逐步提高藥物濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)法[6]，將已耐受紅霉素和慶大霉素的雙親菌株，在完全培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，提高其耐藥性，并穩(wěn)定至選擇融合子的應(yīng)用濃度.

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的繪制[7-8]

供試菌株分別在液體完全培養(yǎng)基中 28 ℃振蕩培養(yǎng)，用分光光度計(jì)分別測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)的吸光度(OD600)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制兩親本菌株的生長(zhǎng)曲線.

1.2.4 原生質(zhì)體的制備、融合及再生

原生質(zhì)體的制備、融合方法見文獻(xiàn)[10].

融合子的檢出：用影印法[10]，將長(zhǎng)出的菌落移植在含紅霉素和慶大霉素的雙抗選擇培養(yǎng)基上，48 h后再次影印在雙抗平板上，使融合株充分分離，在第2次雙抗平板上長(zhǎng)出的菌株，可初步認(rèn)為是融合株.

原生質(zhì)體形成率=(未經(jīng)酶處理菌數(shù)－經(jīng)酶處理后剩余菌數(shù))/未經(jīng)處理的總菌數(shù).原生質(zhì)體再生率=(再生培養(yǎng)基上總菌數(shù)－經(jīng)酶處理后剩余菌數(shù))/原生質(zhì)體數(shù).融合率=融合子數(shù)/平均兩親本再生原生質(zhì)體數(shù).

檢出融合菌株后，在雙抗選擇培養(yǎng)基上用影印法連續(xù)傳代12次，每代在28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d，最后長(zhǎng)出的菌落可視為穩(wěn)定的融合菌株.

1.2.5 親本及融合菌株的DNA檢測(cè)

按文獻(xiàn)[11]方法提取親本菌株和融合菌株的DNA，并測(cè)定其含量，取 1 000 bp DNA Ladder Marker及各DNA樣10 μL 進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，拍照.采用F檢驗(yàn)法對(duì)DNA含量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 58-20-9菌株和G4菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的選擇

由圖1可知，58-20-9菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期為5～6 h，G4菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期為6～7 h.

圖1 58-20-9菌株與G4菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 Curves describing the growth of strains 58-20-9 and G4

2.2 溶菌酶質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間對(duì)兩親株原生質(zhì)體形成率和再生率的影響

從圖2、圖3可以看出，原生質(zhì)體形成率隨溶菌酶質(zhì)量濃度增加而提高，但再生率呈下降趨勢(shì).同時(shí)，原生質(zhì)體形成率隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)而增加，再生率則下降，因此，將58-20-9菌株和G4菌株的酶解質(zhì)量濃度確定為 4 mg/mL，酶解時(shí)間確定為 40 min.此時(shí)在較高的原生質(zhì)體形成率下原生質(zhì)體再生率也相對(duì)較高(圖3).試驗(yàn)結(jié)果表明，58-20-9菌株的細(xì)胞壁比G4菌株的對(duì)溶菌酶更敏感.

圖2 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響Fig.2 The effect of concentration on formation rate of protoplast

圖3 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響Fig.3 The effect of concentration on protoplast regeneration rate

2.3 原生質(zhì)體融合及融合子的檢出

2.3.1 原生質(zhì)體融合

經(jīng)EDTA和溶菌酶脫壁后的58-20-9菌株和G4菌株的原生質(zhì)體呈球狀，與親本菌的短桿狀有明顯區(qū)別.當(dāng)兩者的原生質(zhì)體混合后，在40% PEG6000與新生磷酸鈣液的促融下，在顯微鏡下可看到凝聚現(xiàn)象.當(dāng)把出發(fā)菌株58-20-9和G4分別涂布在雙抗選擇培養(yǎng)基平板上，均不長(zhǎng)出菌落.將融合的原生質(zhì)體涂布在高滲再生培養(yǎng)基平板上，細(xì)胞壁恢復(fù).48 h后待菌落長(zhǎng)出再連續(xù)2次影印在含紅霉素和慶大霉素的雙抗選擇培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后長(zhǎng)出較小菌落，即為兩親株的原生質(zhì)體融合體的再生菌.為了計(jì)算融合率，從高滲再生培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取5 000個(gè)菌落，用滅菌牙簽點(diǎn)種于雙抗選擇平板上，培養(yǎng)48 h后于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)僅有 16個(gè)小菌落生長(zhǎng)良好，視為融合子，融合率達(dá)4‰.

2.3.2 融合子穩(wěn)定性鑒定

點(diǎn)種500個(gè)融合子菌落在雙抗平板上，連續(xù)影印傳代，隨著傳代次數(shù)的增加，能在雙抗平板上生長(zhǎng)的融合子數(shù)目逐漸減少，待傳代12代時(shí)，僅有1個(gè)融合子菌落仍生長(zhǎng)良好，且能穩(wěn)定傳代，說明此融合子遺傳性穩(wěn)定.因在試驗(yàn)中用DNAase排除了外源DNA的轉(zhuǎn)化，說明此融合株是由兩親本菌株原生質(zhì)體融合的結(jié)果，將該菌株定名為AM-l菌株.

2.4 親本菌株及融合菌株的DNA含量

3次測(cè)量的親本菌及融合菌株的 DNA含量見表1.由表1可知，OD260/OD280主要介于1.7～1.9，說明純度可靠，融合菌株AM-l的DNA含量均高于58-20-9菌株和G4菌株的DNA含量，經(jīng)檢驗(yàn)，差異均達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01).

表1 親本菌株及融合菌株的DNA含量Table 1 The DNA contents of the syncretic and parents fungus strains μg/mL

親本菌株與融合子DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖 4.融合子 AM-l菌株離點(diǎn)樣孔的距離明顯小于任一親本菌株離點(diǎn)樣孔的距離，說明融合子DNA的相對(duì)分子質(zhì)量比其親本的要大，初步證實(shí)了以上DNA含量測(cè)定結(jié)果.

圖4 菌株DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of agrose gel of DNA

3 討 論

細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體的形成及融合頻率有較大影響.處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量最低，細(xì)胞壁對(duì)酶的作用最敏感，在同等條件下原生質(zhì)體制備率較高，但對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的細(xì)胞相對(duì)較為脆弱，受酶的過度作用會(huì)影響原生質(zhì)體的再生率[12].鑒于此，本試驗(yàn)中兩親本原生質(zhì)體的制備均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的菌液，即58-20-9菌株培養(yǎng)5～6 h，G4菌株培養(yǎng)6～7 h，這樣不僅可獲得較多菌體，而且原生質(zhì)體的再生率也可得到保障.

在原生質(zhì)體制備過程中，菌體的預(yù)處理、酶解濃度和時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑是3個(gè)制約性的因素[13].筆者采用EDTA加溶菌酶處理，對(duì)溶菌酶的濃度和酶解時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)選.試驗(yàn)證明，58-20-9菌株和G4菌株的酶解濃度為4 mg/mL，酶解時(shí)間為40 min，此時(shí)在較高的原生質(zhì)體形成率下原生質(zhì)體再生率也相對(duì)較高.在維持原生質(zhì)體活力的條件下，一般以較低滲的介質(zhì)有利于融合[12].筆者在原生質(zhì)體制備中加入氯化鎂、順丁烯二酸、甘露醇等滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂，同時(shí)也促進(jìn)酶與底物的結(jié)合.2種原生質(zhì)體等量混合后，加入PEG處理后原生質(zhì)體仍呈球狀.

原生質(zhì)體融合后，融合子為抗性互補(bǔ)的雙耐藥菌株.筆者最初采用通常的直接法，即將融合后的原生質(zhì)體直接涂布于雙抗再生培養(yǎng)基上，但未得到融合子.后將融合后的原生質(zhì)體先涂在不含藥的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，再用影印法轉(zhuǎn)到含紅霉素和慶大霉素的雙抗選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)才得到融合株.究其原因，可能是雙耐藥融合子的檢出需要有48 h的表型延遲期.Szxoboda[14]在研究小單胞菌原生質(zhì)體融合時(shí)也發(fā)現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象.出發(fā)菌的原生質(zhì)體在雙抗選擇培養(yǎng)基上亦能生長(zhǎng)，這一特殊選擇主要是鑒別雜菌.雜菌在含2種抗生素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng).若親本不生長(zhǎng)，融合子生長(zhǎng)，則說明該融合子未繼承原有特性.在原代融合平板上加入2種抗生素，可以保證生長(zhǎng)的菌或者是形成雜合雙倍體或單倍重組體的真正融合，因此，對(duì)這些菌連續(xù)傳代 10次后仍不回復(fù)的可以認(rèn)為是真正的融合子[15].對(duì)融合子及其親本的DNA含量進(jìn)行測(cè)定及瓊脂糖凝膠電泳分析，證實(shí)了融合子的DNA含量高于任一親本，其運(yùn)動(dòng)位置明顯靠后，這也與劉玲等[16]的研究結(jié)果類似，但這些還不能完全從遺傳學(xué)上闡明融合子的遺傳規(guī)律，下一步在運(yùn)用融合子開展規(guī)?；呙缟a(chǎn)之前，仍有待于應(yīng)用16srDNA等技術(shù)鑒定融合子AM-1菌株與親本的異同，并對(duì)融合子攜帶的隱性或顯性表達(dá)的遺傳信息及其可能影響融合疫苗免疫效果的相關(guān)性狀予以檢測(cè).

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