張樂(lè)穎，王加啟，楊永新，卜登攀，李珊珊，魏宏陽(yáng)

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河北工程大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 邯鄲 056021)

圍產(chǎn)期是奶牛泌乳周期乃至一生中最為關(guān)鍵的時(shí)期.由于妊娠、分娩和泌乳的應(yīng)激，易使奶牛處于免疫抑制狀態(tài)[1]，進(jìn)而產(chǎn)后發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、乳房炎和胎衣不下等[2-4].通過(guò)補(bǔ)充維生素來(lái)緩解圍產(chǎn)期奶牛免疫抑制，減少疾病發(fā)生，提高機(jī)體免疫力，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此做了大量研究.曹榮等[5]在奶牛產(chǎn)前日糧中添加維生素D3(V-D3)緩解了圍產(chǎn)期奶牛免疫球蛋白(Ig)的下降，提高了中性粒細(xì)胞含量.中性粒細(xì)胞是奶牛抵御乳房炎病原菌的第一道防線，是非特異性免疫系統(tǒng)最重要的細(xì)胞，添加V-D3后，中性粒細(xì)胞數(shù)量提高，表明日糧中添加V-D3提高了機(jī)體的非特異性免疫.何文娟等[6]在圍產(chǎn)期日糧中添加β-胡蘿卜素(V-A前體)，不僅提高了產(chǎn)乳量，而且還降低了胎衣不下、子宮炎和乳房炎的發(fā)病率.產(chǎn)前一周，每毫升血清中的V-E含量每增加1 μg，胎衣不下的發(fā)生率將降低20%，V-A的含量每增加100 ng，臨床性乳房炎的發(fā)病率將降低60%[7].然而，迄今尚未有關(guān)于復(fù)合V-AD3E注射液對(duì)圍產(chǎn)期奶牛營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方面的報(bào)道.為此，筆者采用雙向電泳結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜的方法，從乳蛋白整體規(guī)模探索了復(fù)合V-AD3E 對(duì)圍產(chǎn)期奶牛乳蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下.

1 材料與方法

1.1 樣品采集及制備

于天津三元綠荷二牧牛場(chǎng)選取健康、體重接近、預(yù)產(chǎn)期相近的中國(guó)荷斯坦初產(chǎn)奶牛24頭，其中12頭在預(yù)產(chǎn)期前15 d注射V-AD3E 20 mL (每mL含V-A 50 000 IU、V-D325 000 IU、V-E 乙酸酯4.0 mg)，另12頭為對(duì)照組(不注射).奶牛以全混日糧(TMR)方式飼喂，日喂2次，擠奶3次，自由飲水.分別在產(chǎn)后第1天和第21天收集奶樣，按早、中、晚4∶3∶3比例混合后，取120 mL制備乳蛋白樣品.乳樣在4℃、3 000 g離心15 min，棄上層乳脂，收集清液即為牛乳蛋白.經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行蛋白定量后，－80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 2-DE

第一向等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)電泳：采用膠內(nèi)溶脹法，將300 μg的乳蛋白樣品與350 μL水化上樣緩沖液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2 % IPG Buffer(pH3-10)，0.001%溴酚藍(lán))混勻(漩渦振蕩5 min)，10 000 g離心2 min，吸取上清，均勻加入至聚焦盤中，進(jìn)行等電聚焦.結(jié)束后，將膠條用2.0%DTT平衡緩沖液還原，2.5%碘乙酰胺平衡緩沖液烷基化[8]，然后進(jìn)行12%SDS-PAGE垂直電泳，循環(huán)水浴溫度為12 ℃，程序設(shè)置為：1 W、30 min；2 W、1 h，最后48 W直到溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠的底部.

1.3 凝膠染色和圖像分析

凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色(0.12% G-250，10%(NH4)2SO4，10% H3PO4，20% Methanol)[9].Umax掃描儀采集圖像，Image Master 6.0軟件進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、自動(dòng)匹配.試驗(yàn)重復(fù)3次.將注射組與不注射組凝膠圖譜以斑點(diǎn)染色強(qiáng)度和面積2倍量的變化為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異分析，檢測(cè)差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn).

1.4 蛋白質(zhì)酶解

切去槍頭尖端，使其直徑約2 mm，選取差異表達(dá)的區(qū)域，分離后置于1.5 mL離心管中.先用超純水清洗2次，每次15 min，再向每管加入150 μL脫色液(50%乙腈＋50% 25 mmol/L碳酸氫銨)，室溫放置30 min，重復(fù)1次.抽真空離心干燥(Savant,Speed Vac Concentrator)30 min ，然后向干燥凝膠顆粒中加入 10 μL 20 ng/μL 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，37 ℃過(guò)夜.吸出酶解液，加入8 μL 2.5%三氟乙酸＋50%乙腈，30 ℃放置1 h，吸出的液體與前一次的合并，重復(fù)1次.

1.5 離子阱質(zhì)譜檢測(cè)

酶解肽混合物采用液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)(LCQ Deca XP plus，Thermo Finnigan)分析.上樣前，先用流動(dòng)相 A(超純水＋0.1%甲酸)平衡色譜柱(C18, Milford, MA, USA)，再用流動(dòng)相B(乙氰＋0.1%甲酸)線性梯度洗脫 120 min.樣品上樣量 20μL，流速 110 μL/min.質(zhì)譜全掃描范圍：m/z 400～2 000，MS/MS 數(shù)據(jù)依賴掃描 5次(噴霧電壓 3.2 kV，溫度160 ℃)，數(shù)據(jù)采集在正離子模式下運(yùn)行.所獲數(shù)據(jù)用整合在質(zhì)譜儀上的Bioworks中的SEQUEST搜索NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù).檢索結(jié)果輸出后，采用Single threshold參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果進(jìn)行篩選，當(dāng) Xcorr 分?jǐn)?shù)為1.9、2.2、3.75時(shí)，相應(yīng)電荷為＋1、＋2、＋3.

2 結(jié)果與分析

2.1 乳蛋白的差異表達(dá)檢測(cè)

由圖1可見(jiàn)，與不注射組第1天的凝膠圖譜相比，注射組第1天的乳蛋白圖譜上有5個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)(圖 1-A、B)；在第21天，注射組與對(duì)照組在蛋白表達(dá)上差異不明顯(圖1-C、D).

圖1 乳蛋白表達(dá)圖譜Fig.1 Analysis of expression protein patterns of bovine milk

2.2 差異表達(dá)蛋白的鑒定

經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜分析肽質(zhì)量，并用整合在質(zhì)譜儀上的Bioworks 軟件中的檢索軟件 SEQUEST搜索NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，差異表達(dá)蛋白主要對(duì)應(yīng)于2種蛋白——免疫球蛋白G (IgG)和白蛋白，如表1所示.

表1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定初乳和常乳差異表達(dá)蛋白Table 1 Identification of differential expression protein from colostrum and milk by LC/MS/MS

3 小結(jié)與討論

牛初乳中的IgG和白蛋白絕大部分來(lái)自血液[10]，分娩前幾周由于乳房的膨脹、血管滲透性增加，使得血液中IgG 和白蛋白等進(jìn)入乳腺[8,11].新出生的犢牛血清中幾乎沒(méi)有抗體[12]，因此犢牛對(duì)病原菌的抵抗主要依靠初乳提供的被動(dòng)免疫.及時(shí)地讓犢牛吃上初乳很重要，因?yàn)榉雌c動(dòng)物胎盤不允許母源抗體通過(guò)，而且犢牛的自身免疫系統(tǒng)需要數(shù)周甚至數(shù)月才能成熟[13].

有關(guān)維生素對(duì)機(jī)體的作用，前人作了很多研究.產(chǎn)前一個(gè)月，每周給奶牛注射 V-AD3E 1次(每次注射量：V-A 80 000 IU、V-D340 000 IU，V-E 20 mg)，可顯著降低胎衣不下的發(fā)生率，而且還可縮短分娩后再次妊娠的時(shí)間[14].Waller 等給瑞典東南部21個(gè)牛群中的圍產(chǎn)期奶牛每天補(bǔ)充V-E 乙酸鹽1 610 mg(從產(chǎn)前 4 周到產(chǎn)后2周)，顯著降低了犢牛出生后 24 h內(nèi)的死亡率[15].此外，給斷奶前小母牛補(bǔ)充V-ADE，顯著降低了腹瀉率[16].體外試驗(yàn)表明，補(bǔ)充V-A 促進(jìn)了幼齡動(dòng)物臍帶血合成IgM的量和成年動(dòng)物外周血單核細(xì)胞合成IgG的量[16].V-A及其代謝產(chǎn)物作為免疫增強(qiáng)劑，使抗體對(duì)依賴抗原的T細(xì)胞做出應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增值、抑制細(xì)胞凋亡[18].本試驗(yàn)結(jié)果表明，V-AD3E聯(lián)合作用，上調(diào)了初乳中IgG和白蛋白等蛋白的表達(dá)，這不僅為飼喂初乳的犢牛提供了更好的免疫保護(hù)，也為犢牛腸道的正常發(fā)育和母牛乳房功能的正常發(fā)揮提供了必要保障.此外，還提高了處于免疫抑制階段母牛對(duì)疾病的抵抗力.

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