王輝憲，馬玉美，羅啟枚，謝聃，劉東波， 熊興耀*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.理學(xué)院；b.園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

原花青素(procyanidins，簡(jiǎn)稱PC)是植物中廣泛存在的一類屬于雙黃酮衍生物的天然多酚化合物，有人將其歸為生物類黃酮[1-2]，也有人將其歸為縮合鞣質(zhì)[3].這類化合物由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，最簡(jiǎn)單的是兒茶素、表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體.原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化特性，一般存在于植物的果實(shí)、種子、花和皮中，在葡萄、山楂、花生、銀杏、白樺樹(shù)、松樹(shù)等植物中的含量都很豐富[4].在原花青素各種不同聚合體中以二聚體B2的抗氧化能力最強(qiáng).原花青素具有多種生物活性，能防治多種疾病，具有高效、低毒、高生物利用率等特點(diǎn)，在植物中的主要作用是保護(hù)植物中易被氧化的成分，在人體內(nèi)的抗氧化和清除自由基的能力是V-E的50倍、V-C的20倍[5-6]，并且還具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變及美容等作用[7].中國(guó)葡萄資源豐富，每年用于釀造酒和其他飲料的鮮葡萄超過(guò)10萬(wàn)t，每年生產(chǎn)葡萄酒后的廢渣中就有(400～600)萬(wàn)kg的葡萄籽[8].葡萄籽中含有大量的原花青素，因此充分利用好釀酒后的葡萄籽資源，不僅物盡其用，而且還會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益.筆者研究大孔樹(shù)脂分離純化葡萄籽原花青素的方法和工藝，旨在為刺葡萄的綜合利用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料、儀器與試劑

以湖南懷化市芷江地區(qū)出產(chǎn)的高山刺葡萄籽為試材；原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自SEGMA公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(≥95%)購(gòu)自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司(探索試驗(yàn)條件所用原花青素為80%的低聚原花青素產(chǎn)品)；8種大孔樹(shù)脂(表1)均為乳白色不透明球狀顆粒，購(gòu)自滄州遠(yuǎn)威化工有限公司和滄州寶恩化工有限公司.

表1 8種樹(shù)脂的性能參數(shù)Table 1 Capability parameter of 8 macroporous resins

主要儀器為組合恒溫磁力攪拌器、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、DLSB-5/10型低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、D2-2BC型真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)、ES-1100電子天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司)、VIS-7220紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器廠)和玻璃層析柱.

主要試劑乙醇(95%)、乙酸乙酯、正丁醇、濃鹽酸、NH4Fe(SO4)2、NaCl均為分析純；甲醇為色譜純.

1.2 方 法

1.2.1 葡萄籽中原花青素的提取與初步分離

將1 kg刺葡萄籽粉碎，用超臨界CO2法提取葡萄籽油脫脂[9-10]后，用 5%NaCl水溶液以 1∶5的料液比攪拌1 h去蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行原花青素的提取[11].提取液為 70%的乙醇溶液，料液比 1∶7，溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h.提取2次.將上述原花青素的提取液減壓蒸餾(45 ℃)至無(wú)醇，離心分離，上清液用4倍體積的乙酸乙酯分6次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，減壓蒸餾(≤35 ℃)至有少量沉淀析出后置于真空干燥箱干燥(≤30 ℃)2 h，得低聚原花青素粗產(chǎn)品，備用.

1.2.2 提取物中原花青素含量的測(cè)定

在文獻(xiàn)[12-13]的基礎(chǔ)上，對(duì)鐵鹽濃度和濃鹽酸-正丁醇的比例進(jìn)行改進(jìn)后，測(cè)定提取物中原花青素的含量.

1.2.3 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

取8種型號(hào)的大孔樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，用無(wú)水乙醇沖至無(wú)渾濁，用蒸餾水洗至無(wú)醇味.經(jīng)酸、堿處理后用蒸餾水洗至中性[14-15].

1.2.4 樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)

(1)靜態(tài)吸附試驗(yàn).分別準(zhǔn)確稱取0.500 0 g預(yù)處理過(guò)的8種大孔樹(shù)脂于錐形瓶中，分別加入5 mL無(wú)水乙醇使樹(shù)脂充分漲溶，再分別加入50 mL原花青素水溶液(原花青素含量為0.4 mg/mL)，封口，置于25 ℃水浴搖床中振搖24 h，測(cè)定溶液吸光度，檢測(cè)樹(shù)脂的吸附量.

Qe為樹(shù)脂吸附量(mg/g)；C0為吸附前溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；C1為吸附后溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V1為溶液體積(mL)；W為樹(shù)脂干重(g).

(2)靜態(tài)解吸試驗(yàn).將上述充分吸附后的原花青素水溶液進(jìn)行過(guò)濾，去除水液，再將其置于錐形瓶中，各加入50%的乙醇水溶液50 mL，封口，置于25 ℃水浴搖床中振搖24 h，檢測(cè)樹(shù)脂的解吸率，并根據(jù)靜態(tài)吸附和靜態(tài)解析試驗(yàn)確定最佳樹(shù)脂.

Qd為解析量(mg/g)；C2為解析液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)； V2為解析液體積(mL)；D為解析率.

1.2.5 吸附、解吸條件的確定

(1)吸附條件的確定.取0.500 0 g預(yù)處理過(guò)的所選最佳樹(shù)脂，加入0.4 mg/mL原花青素水溶液50 mL，以吸附時(shí)間、吸附溫度和供試液pH值設(shè)計(jì)L16(43)正交試驗(yàn)，用鹽酸-正丁醇法測(cè)定吸附完全后原花青素溶液的吸光度，考察吸附條件對(duì)樹(shù)脂吸附性能的影響，確定最佳吸附條件.

(2)解吸條件的確定.取0.500 0 g所選最佳樹(shù)脂，加入0.4 mg/mL原花青素水溶液50 mL，在相同條件下吸附飽和后，濾去水溶液，以乙醇水溶液濃度、pH值、洗脫時(shí)間及洗脫溫度設(shè)計(jì)L16(44)正交試驗(yàn)，用鹽酸-正丁醇法測(cè)定解吸完全后原花青素溶液的吸光度，考察洗脫條件對(duì)解吸效果的影響，確定最佳解吸條件.

1.2.6 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

(1)上柱速率對(duì)吸附量的影響.分別取一定量處理過(guò)的所選樹(shù)脂濕法裝柱，以0.4 mg/mL原花青素溶液上柱，調(diào)節(jié)不同上柱速率，收集流出液.每收集10 mL流出液用鹽酸-正丁醇法測(cè)量1次其中原花青素的含量，考察上柱速率2、4、6 BV/h對(duì)樹(shù)脂吸附性能的影響.

(2)洗脫速率對(duì)洗脫解吸率的影響.分別取一定量處理過(guò)的所選樹(shù)脂濕法裝柱，給定相同的上柱條件，按最佳吸附條件進(jìn)行吸附，使其飽和，以不同的洗脫速率洗脫，考察洗脫速率 1、2、3 BV/h對(duì)洗脫效果的影響.

通過(guò)上述試驗(yàn)，確定所選樹(shù)脂對(duì)原花青素吸附分離的最佳工藝條件.

1.2.7 刺葡萄籽低聚原花青素的純化

將溶劑浸提所得低聚原花青素粗提物溶于蒸餾水中，以上述試驗(yàn)所選定的樹(shù)脂為吸附劑，上柱吸附至飽和，然后以60%乙醇水溶液按最佳工藝條件進(jìn)行洗脫，每10 mL收集1次洗脫液，用鹽酸-正丁醇法測(cè)定洗脫液中原花青素的含量.

1.2.8 純化物中B2含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.001 0 g原花青素二聚體B2標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇(GR)定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的B2標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋，配制成質(zhì)量濃度為15、30、45、60、75 μg/mL的原花青素二聚體B2系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.通過(guò)HPLC法測(cè)定原花青素二聚體B2標(biāo)準(zhǔn)曲線.測(cè)定條件：流動(dòng)相甲醇與水的體積比為24∶76，并經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，脫氣；流速 0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL.在相同條件下測(cè)定1.2.1方法所得低聚原花青素粗產(chǎn)品(質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL)和經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后純化物(原花青素質(zhì)量濃度為120 μg /mL)中B2的峰面積，計(jì)算B2的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 刺葡萄籽中原花青素的初步提取與分離結(jié)果

將處理過(guò)的 1 kg刺葡萄籽在最佳提取條件下進(jìn)行提取，乙酸乙酯萃取后得到低聚粗產(chǎn)品 4.608 g，正丁醇萃取后得高聚粗產(chǎn)品4.251 g，產(chǎn)品總質(zhì)量為8.859 g，得率為0.89%.

2.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以鹽酸-正丁醇法測(cè)定原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y =0.859 7x + 0.011 3，R2=0.999 2，式中y為吸光度，x為溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL).

2.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 樹(shù)脂的篩選

原花青素具有多酚鍵和糖苷鍵，有一定的極性和親水性，生成氫鍵的能力較強(qiáng)，有利于極性和弱極性的樹(shù)脂吸附，但吸附能力太強(qiáng)不利于解吸.由表2可見(jiàn)，所用樹(shù)脂吸附效果最好的是HPD- 300，其次是 HPD-700、YWD-03K7、YWD-04B1和YWD-06C，幾種樹(shù)脂的吸附能力相差不大，其中HPD-700和YWD-03K7樹(shù)脂的吸附能力完全相同.

表2 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附情況Table 2 Static adsorption of the resin

由表3可見(jiàn)，解吸率最高的樹(shù)脂是YWD-06C，其次是D-101、YWD-09F和HPD-700，因此，綜合考慮，選取YWD-06C為最佳樹(shù)脂.

表3 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)解吸情況Table 3 Static desorption of the resin

2.3.2 吸附條件正交試驗(yàn)結(jié)果

吸附后測(cè)得溶液的吸光度越小，吸附效果越好.由表4可知，在吸附過(guò)程中各因素對(duì)吸附效果的影響都較大，其中吸附時(shí)間的影響最大.時(shí)間太短，吸附不完全；時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)使原花青素在樹(shù)脂中重新解吸出來(lái).50 ℃時(shí)吸光度較大可能是原花青素在較高溫度下發(fā)生分解生成色素所致.最佳吸附條件為吸附溫度20 ℃，吸附時(shí)間6 h，溶液pH 4.

表4 吸附條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The orthogonal analysis of adsorption

2.3.3 解吸條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，解吸時(shí)間對(duì)解吸效果影響最大，這是由于時(shí)間太短，解吸不完全；時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)使解吸出來(lái)的原花青素重新吸附到樹(shù)脂上.其他3個(gè)因素對(duì)解吸效果的影響基本相同.最佳解吸條件：解吸液為60%的乙醇水溶液，pH 4，解吸時(shí)間6 h，解吸溫度25 ℃.

表5 解吸條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The orthogonal analysis of adsorption

2.4 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 吸附流速對(duì)吸附量的影響

以流出液體積為橫坐標(biāo)，以流出液中原花青素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，得上柱速率對(duì)吸附量影響的關(guān)系曲線(圖1).由圖1可知，當(dāng)流速為2 BV/h時(shí)，樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附比較完全，但由于流速太慢，使得操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；當(dāng)流速為6 BV/h時(shí)，由于流速過(guò)快，原花青素還未被樹(shù)脂完全吸附就隨洗脫液流出，造成原花青素的浪費(fèi)，因此選取 4 BV/h為最佳吸附流速.

圖1 不同吸附流速下樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附Fig.1 Adsorption of different flowing velocity

2.4.2 洗脫速率對(duì)吸附量的影響

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)[16]，洗脫速率一般為吸附速率的1/2，故筆者考察1、2、3 BV/h 3個(gè)洗脫速率對(duì)吸附量的的影響.以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中原花青素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，得不同流速下樹(shù)脂對(duì)原花青素的解吸曲線(圖2).由圖2可見(jiàn)，洗脫速率越小，洗脫越完全；1 BV/h時(shí)雖然洗脫效果較好，但由于流速過(guò)慢，使得操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；流速為2 BV/h時(shí)，洗脫曲線集中，對(duì)稱，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象；流速為 3 BV/h時(shí)，流速較快，洗脫不完全，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，所以，選取2 BV/h為最佳流速.

圖2 不同洗脫速率下樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附Fig.2 Desorption curve of different flowing velocity

2.5 刺葡萄籽低聚原花青素的純化

根據(jù)靜態(tài)試驗(yàn)和動(dòng)態(tài)試驗(yàn)確定的吸附、解吸條件，對(duì)用溶劑法提取的低聚原花青素粗提物進(jìn)行純化，用鹽酸-正丁醇法測(cè)定洗脫液中原花青素的含量，結(jié)果表明，原花青素主要集中在第3組洗脫液，即20～30 mL階段，此階段洗脫液中原花青素含量達(dá)到92.57%.

2.6 純化物中原花青素B2的含量

按1.2.8色譜條件，用HPLC法分別得到原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品與純化物的色譜圖(圖3、圖4).

圖3 原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.3 HPLC spectrum of B2 standard product

圖4 原花青素純化物的HPLC圖Fig.4 HPLC spectrum of purified proanthocyanidins

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，得刺葡萄籽低聚原花青素純化物中二聚體B2峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程由刺葡萄籽低聚原花青素純化物中二聚體B2峰面積與質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得刺葡萄籽低聚原花青素純化物中二聚體B2的質(zhì)量濃度為40.17 μg/mL，計(jì)算可得二聚體B2含量為33.5%.同樣方法可測(cè)得溶劑法粗提所得低聚原花青素中二聚體B2的含量為9.19%.

3 結(jié)論與討論

利用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)溶劑法所得刺葡萄籽低聚原花青素粗產(chǎn)品進(jìn)行純化.通過(guò)靜態(tài)試驗(yàn)選擇出YWD-06C樹(shù)脂為最佳吸附劑，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳吸附條件：吸附溫度20 ℃，吸附時(shí)間6 h，溶液pH值為4；最佳解吸條件：解吸液為60%的乙醇水溶液，pH值為4，解吸時(shí)間6 h，解吸溫度25 ℃；通過(guò)動(dòng)態(tài)試驗(yàn)確定吸附速率為4 BV/h，洗脫速率為2 BV/h.刺葡萄籽低聚原花青素粗提物經(jīng)YWD-06C樹(shù)脂純化后，收集20～30 mL階段洗脫液，用鹽酸-正丁醇法測(cè)得其中原花青素含量達(dá)92.57%.用本方法純化刺葡萄籽低聚原花青素，不僅可以去除提取物中大部分雜質(zhì)，提高原花青素的含量，而且可以富集原花青素純化物中的二聚體B2，葡萄籽低聚原花青素產(chǎn)品中B2含量的提高，將大大提高產(chǎn)品的抗氧化能力和藥用價(jià)值，也將大大提高產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，本純化工藝對(duì)于葡萄籽的綜合利用、對(duì)于提高葡萄籽低聚原花青素產(chǎn)品的品質(zhì)、對(duì)于提升刺葡萄深加工的價(jià)值具有非常好的應(yīng)用前景.

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