李博，黃麗華，蔣向，李育強(qiáng)，張學(xué)文*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南 常德 415101)

亞麻是最早取得轉(zhuǎn)基因成功的作物之一，1987年通過(guò)愈傷組織轉(zhuǎn)化獲得了亞麻轉(zhuǎn)基因植株[1].McHugen等1989年建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將ALS基因?qū)雭喡?，獲得了抗除草劑草胺磷的轉(zhuǎn)基因品種，并已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)[2].抗磺隆類除草劑轉(zhuǎn)基因品種CDC Triffid于1996年獲得轉(zhuǎn)基因品種登記證書(shū)[3]. Zhan Xiangcan等發(fā)現(xiàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染亞麻下胚軸和子葉可以形成發(fā)根并可發(fā)育成再生植株[4].王玉富等以亞麻幼苗下胚軸為外植體，利用抗除草劑Basta的目的基因Barnase和GUS-INT基因，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了亞麻轉(zhuǎn)基因[5].王毓美等以幾丁質(zhì)酶基因?qū)喡榈倪z傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗性小芽生根篩選及葉片抗性檢測(cè)，推斷幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到亞麻基因組中[6].康慶華等[7]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行亞麻黑亞11號(hào)和黑亞9號(hào)轉(zhuǎn)抗除草劑Basta 基因轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)化的愈傷組織[8].黑龍江省亞麻原料工業(yè)研究所與中科院遺傳研究所合作進(jìn)行兔防御素NP-1基因[9]在轉(zhuǎn)基因亞麻中的表達(dá)及其對(duì)亞麻枯萎病[10]和立枯病[11]的抗性研究，目前已獲得了轉(zhuǎn)基因植株.

亞麻作為草本作物，在規(guī)?；耘噙^(guò)程中雜草控制比較困難，抗除草劑的基因工程研究中，最受關(guān)注的是抗草甘膦的基因工程.草甘膦是一種環(huán)境友好型除草劑，其作用的靶為芳香族氨基酸合成過(guò)程的關(guān)鍵酶EPSP合成酶.EPSP催化3-磷酸莽草酸(S3P)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸(EPSP)[12-14]，草甘膦是PEP的類似物，它能與PEP競(jìng)爭(zhēng)性抑制EPSP合成酶的活性，阻斷EPSP的合成，從而阻斷植物芳香族氨基酸的合成，導(dǎo)致植物死亡[15].

蔣向等[16]從具有較強(qiáng)草甘膦抗性的蔥屬植物薤白(Allium macrostemon Bunge)中分離克隆了其EPSP合成酶基因EPSPsA cDNA， 并對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行了分析.筆者利用已克隆的抗草甘膦薤白EPSPsAcDNA，構(gòu)建植物表達(dá)EPSPsA重組載體轉(zhuǎn)化亞麻，以探討薤白抗草甘膦EPSPsA cDNA的表達(dá)及抗草甘膦的作用.

1 材料與方法

1.1 材 料

供試亞麻由中國(guó)農(nóng)科院麻類研究所提供.大腸桿菌InVαF′ 和根癌農(nóng)桿菌LBA4404，克隆的薤白EPSP基因cDNA (pMD-EPSPsA)質(zhì)粒、植物表達(dá)載體 pWM101由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室保存.

亞麻培養(yǎng)采用MS +2 mg/L KT、3.5 mg/L IAA +適量氨基酸進(jìn)行共培養(yǎng)；共培養(yǎng)基+50 mg/L潮霉素B+500 mg/L 頭孢曲松鈉進(jìn)行篩選培養(yǎng)；MS + 0.02 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+50 mg/L潮霉素B+500 mg/L頭孢曲松鈉進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和發(fā)芽；MS+0.01 mg/L NAA誘導(dǎo)生根；YEB培養(yǎng)基：0.5 g/L MgSO4+1 g/L酵母提取物+5 g/L胰化蛋白胨+5 g/L牛肉浸膏+5 g/L蔗糖+15 g/L瓊脂.

1.2 方 法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò) BioEdit 軟件分析 EPSP基因中的酶切位點(diǎn)， 結(jié)合植物表達(dá)載體pWM101 上的多克隆位點(diǎn)，在克隆載體pMD-EPSPsA上、下游分別引入XbaⅠ和 PstⅠ限制內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物分別為上游引物 P1：5′-AACTGCAGGATGGTTCAGCAAT GCTGAC-3′和下游引物 P2：5′-GCGTCGACCCAT CGAAGCACCTGGTTC-3′，構(gòu)建表達(dá)載體(圖 1).用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行 Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選，選取白色菌落做菌落PCR.將檢測(cè)為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，強(qiáng)堿法制備質(zhì)粒DNA，以限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和PstⅠ酶切.檢測(cè)重組質(zhì)粒插入目的片段的情況后，采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建正確的表達(dá)載體 pWM-EPSPsA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404.

圖1 植物表達(dá)載體pWM101-EPSPsA的構(gòu)建Fig.1 Construction of plant expression vector pWM101-EPSPsA

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌的電激轉(zhuǎn)化

將根癌農(nóng)桿菌LBA4404 單菌落接入5 mL YEB培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.以10%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL YEB培養(yǎng)液中，28 ℃、150 r/ min 振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為0. 8～1.2). 4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集菌體，用預(yù)冷的無(wú)菌雙蒸水洗滌4次，用無(wú)菌預(yù)冷10%的甘油洗滌，離心，以Bio-Rad電激儀轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌.

1.2.3 農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化亞麻下胚軸

選擇飽滿度好、有光澤的供試亞麻種子， 用75%的乙醇浸5 min 后，用20%的漂白液浸20 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，接種到MS培養(yǎng)基上， 在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d.在使用前2 d置于22 ℃、每天16 h光照條件下培養(yǎng)備用.工程農(nóng)桿菌YEB液體培養(yǎng)基加卡那霉素50 mg/L、28 ℃搖瓶培養(yǎng)2 d.將50 mL培養(yǎng)物4 000 g離心收集細(xì)菌，用MS液體培養(yǎng)基懸浮細(xì)菌，使OD600值0.5～0.6.將備用的亞麻下胚軸剪成0.3～0.5 cm 的小段，用農(nóng)桿菌懸浮液浸10～20 min，無(wú)菌濾紙吸干后分別接種到頂層置濾紙的培養(yǎng)基上.24～26 ℃、每天光照16 h共培養(yǎng)3 d后，用10 mmol/L MgSO4浸10～20 min，控制農(nóng)桿菌的繼續(xù)生長(zhǎng).將培養(yǎng)3周的愈傷組織接種到再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基，24～26 ℃、每天光照14～16 h，誘導(dǎo)再生植株生長(zhǎng).將獲得的再生芽接種到含有抗性篩選的抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選2次.再生植株3～5 cm 時(shí)轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基上.誘導(dǎo)生根一個(gè)月后，大部分苗已長(zhǎng)出繁茂的根，將PCR陽(yáng)性苗移入珍珠巖中培養(yǎng)，當(dāng)株高達(dá)到20 cm左右，根系比較發(fā)達(dá)以后，移栽至土壤獲得轉(zhuǎn)基因亞麻苗，在移栽的同時(shí)種植同品種的未轉(zhuǎn)化種子作對(duì)照.

1.2.4 轉(zhuǎn)基因亞麻的PCR檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因亞麻和對(duì)照亞麻嫩葉，采用安比奧公司GenoDNA Plant Mini Kit試劑盒提取基因組DNA，作為PCR反應(yīng)模板.以P1、P2為引物，pWM-EPSPsA質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因情況.

1.2.5 轉(zhuǎn)基因亞麻的草甘膦抗性檢測(cè)

將通過(guò)潮霉素抗性篩選的愈傷組織接種到草甘膦質(zhì)量濃度為0、200、400、800、1 200、2 000和3 000 mg/L MS培養(yǎng)基上，25 ℃、6 h光照和8 h黑暗交替培養(yǎng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因亞麻愈傷組織對(duì)草甘膦的抗性.當(dāng)移栽后的轉(zhuǎn)基因亞麻植株長(zhǎng)到10～15 cm時(shí)，用質(zhì)量濃度為200、400、800和1 000 mg/L草甘膦溶液噴灑葉片，噴后10～15 d 調(diào)查植株草甘膦抗性.

1.2.6 EPSPsA 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

隨機(jī)選取4個(gè)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行EPSPsA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析.取對(duì)照亞麻及轉(zhuǎn)基因亞麻葉片，用Trizol(Introgen)抽提總RNA.采用 Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為半定量 RT-PCR擴(kuò)增的模板.以亞麻18S rRNA為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物，上游引物：5′-ATGATAACTCGACGGATCGC-3′、下游引物：5′-CTTGGATGTGGTAGCCGT-3′，擴(kuò)增片斷大小為189 bp.EPSPsA基因擴(kuò)增引物，上游引物：5′-GTT AACGTCAACAGCTTTCAATCTC-3′，下游引物：5′-ATCCCGACAGTGCTACATATGAGAG-3′，擴(kuò)增片段大小為539 bp.

18 SrRNA與目的基因采用同機(jī)分管擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠照相.

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

植物表達(dá)載體pWM101-EPSPsA按照重組過(guò)程進(jìn)行構(gòu)建后轉(zhuǎn)化大腸桿菌InvαF′，在轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取10個(gè)菌，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè).提取質(zhì)粒，用Xba I和Pst I酶切，獲得大小約1.5 kb 的預(yù)期帶(圖 2).

圖2 表達(dá)載體pWM101-EPSPsA的雙酶切檢測(cè)Fig.2 Identification of the pWM101-EPSPsA digested by Xba I and Pst I

2.2 農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化亞麻

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的下胚軸轉(zhuǎn)入含頭孢曲松鈉(500 mg/L)和潮霉素(50 mg/L)MS固體培養(yǎng)基中，1周后，對(duì)照組下胚軸逐漸褐化死亡.轉(zhuǎn)基因亞麻下胚軸培養(yǎng)3周后，分化出不定芽(圖3).

圖3 轉(zhuǎn)基因亞麻下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)與篩選Fig.3 Transgenic hypocotyl callus induced and screened

2.3 轉(zhuǎn)基因亞麻的PCR檢測(cè)

選取10株轉(zhuǎn)基因植株，分離其葉片基因組DNA，以薤白EPSPsA特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了預(yù)期大小(1.6 kb)的DNA，證明薤白EPSPs基因已經(jīng)整合入亞麻基因組中(圖4).

圖4 轉(zhuǎn)基因亞麻的PCR檢測(cè)Fig. 4 PCR analysis of transgenic flax

2.4 轉(zhuǎn)基因亞麻愈傷對(duì)草甘膦抗性的檢測(cè)

將轉(zhuǎn)基因愈傷組織接種到含不同質(zhì)量濃度的草甘膦培養(yǎng)基上，25 ℃、16 h光照和8 h黑暗交替培養(yǎng)，2周后觀察，對(duì)照愈傷組織在草甘膦質(zhì)量濃度為50 mg /L時(shí)已全部壞死，而轉(zhuǎn)基因亞麻愈傷組織在800 mg/L時(shí)仍可以緩慢生長(zhǎng)，當(dāng)草甘膦質(zhì)量濃度達(dá)到1 200 mg /L時(shí)愈傷才逐步壞死(圖5).

圖5 轉(zhuǎn)基因亞麻愈傷組織的草甘膦抗性Fig. 5 Resistance of transgenic tobacco callus to glyphosate

2.5 轉(zhuǎn)基因亞麻植株對(duì)草甘膦抗性的檢測(cè)

圖6 抗除草劑試驗(yàn)2周后結(jié)果Fig. 6 Transgnic flax resistance to glyphosate

轉(zhuǎn)基因亞麻(圖6)煉苗后轉(zhuǎn)入土壤栽培，壯苗后以草甘膦進(jìn)行噴霧處理，1周后對(duì)照植株明顯變黃，而經(jīng)過(guò)EPSPA基因轉(zhuǎn)化的亞麻植株并無(wú)枯黃變化，2周后未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株莖葉完全變白并枯死，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)化使被轉(zhuǎn)化的亞麻植株獲得了對(duì)草甘膦的抗性.

2.6 EPSPsA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

隨機(jī)選取3株轉(zhuǎn)基因亞麻進(jìn)行RT-PCR(圖7)，在539 bp處擴(kuò)增出特異的目的條帶，表明EPSPsA基因在轉(zhuǎn)基因亞麻中都有一定量的表達(dá).對(duì)照中沒(méi)有檢出EPSPsA，說(shuō)明引物具有較好的特異性，同時(shí)EPSPsA基因的表達(dá)是獲得草甘膦抗性的關(guān)鍵.根據(jù)該結(jié)果推測(cè)轉(zhuǎn)基因亞麻草甘膦抗性的提高是由于EPSPsA基因的導(dǎo)入和過(guò)量表達(dá)引起的.

圖7 轉(zhuǎn)基因亞麻中EPSPsA 基因的表達(dá)Fig.7 Expression of EPSPsA in transgenic flax plants

3 討 論

抗性EPSP轉(zhuǎn)入植物，提高植物對(duì)優(yōu)良除草劑草甘膦的抗性，是獲得抗除草劑農(nóng)作物的有效方法，但轉(zhuǎn)基因所采用的抗性基因都為來(lái)自于細(xì)菌的aroA基因[17]，其轉(zhuǎn)基因的安全性一直令人擔(dān)憂.植物來(lái)源的抗性基因在安全性方面有一定的優(yōu)勢(shì)，但轉(zhuǎn)植物源基因的抗性水平往往達(dá)不到生產(chǎn)應(yīng)用的要求.本研究利用薤白EPSPsA基因進(jìn)行的亞麻遺傳轉(zhuǎn)化，亞麻獲得了抗草甘膦的能力，抗性水平達(dá)到了800 mg/L.抗性的獲得一方面由于薤白EPSPsA具有的一定水平除草劑抗性，也有可能由于基因在高水平啟動(dòng)子的作用下，過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因中靶酶大量的累積所致.

經(jīng)過(guò)分子檢測(cè)結(jié)果證明，目的基因已經(jīng)整合到亞麻基因組中.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因亞麻進(jìn)行草甘膦噴灑試驗(yàn)，也可以看出轉(zhuǎn)基因亞麻植株對(duì)草甘膦的抗性明顯高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M，證明轉(zhuǎn)薤白EPSPsA基因提高亞麻草甘膦抗性的有效性.

[1]Basiran N，Armitage P，Scott R J，et al.Genetic transformation of flax(Linum usitatissimum)by Agrobacterium tumefaciens regeneration of transformed shoots via a callus phase[J].Plant Cell Repoets，1987(6)：396- 399.

[2]Mchughen A.Agrobacterium mediated transfer of chlosulfuron resistance to commercial flax cultivals[J].Plant Cell Report，1989(8)：445-449.

[3]Mc Hughen A， Holm F A.Development and preliminary field testing of a glufosinate ammonium tolerant transgenic flax[J].Can J Plant Sci，1995，75：117- 120.

[4]Zhan Xiang-can，David A Jones，Allen Kerr.Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes[J].Plant Molecular Biology，1988，11(5)：551-559.

[5]王玉富，周思君，劉燕，等.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基的研究[J].中國(guó)麻作，2000，22(1)：14-16.

[6]王毓美，李武興，陳曦，等.幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化亞麻、紅豆草、駱駝刺的同工酶研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2001，21(1)：26-31.

[7]康慶華. 亞麻轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中抗菌素效果的研究[J].中國(guó)麻業(yè)，2005，27(2)：94-97.

[8]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：179-185.

[9]Zhang Wen-He，Zhao Qian，Yu Jing-Juan，et al.Obtaining transgenic maize plants expressing the rabbit defensin(NP-1)gene and evaluation of their disease resistance[J].Chinese Journal of Agricultural Biotechnology，2004(1)：55-59.

[10]E van Rijn，Termorshuizen A J，A H C van.Bruggen storage method affects disease suppression of flax wilt induced by composts[J].Soil Biology and Biochemistry，2007，39(11)：2743-2749.

[11]Aida H，Afify，Ashour As，et al.Biocontrol of flax seedling blight with mixtures of Pseudominas Spp.[J].Pakistan Journal of Biological Scical Sciences，2000，3(3)：368-371.

[12]Carlisle S M，Trevors J T.Glyphosate in the environment[J].Water Air and Soil Pollution，1988，39(3)：409-420.

[13]Alibhai M F，Stallings W C.Closing down on glyphosate inhibition with a new structure for drug discovery[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98(6)：2944-2946.

[14]Du W S，Wa11is N G，Mazzulla M J，et al.Characterization of Streptococcus pneumoniae 5-enolpynevylshikimate-3-phosphate synthase and its actibation by univalent cations[J].Eur J Bioche，2000，267： 222-227.

[15]馬向東，黃春華，周俊初.基因體外誘變[J].微生物學(xué)通報(bào)，2002，29(1)：70-72.

[16]蔣向，戴雄澤，李育強(qiáng)，等.薤白EPSPs基因在不同組織表達(dá)的半定量分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，33(5)：542-545.

[17]姚姝，張保龍，沈新蓮，等.分別轉(zhuǎn) CP4 EPSPS和a roA基因擬南芥對(duì)草甘膦的抗性[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22(3)：302-304.