陳少雄，陳家楠，蔡繼業(yè)

(1.揭陽職業(yè)技術學院 生物系，廣東 揭陽 522000；2.暨南大學 化學系，廣東 廣州 510632）

高等植物葉片氣孔的形態(tài)、數(shù)量以及分布與植物的生理功能關系密切[1]，不同種類的植物，氣孔的形貌各不相同，可以將氣孔作為鑒別植物種類的參數(shù)之一，張菊平等[2]發(fā)現(xiàn)可以利用氣孔保衛(wèi)細胞的周長來鑒定辣椒植株是否屬于單倍體或是二倍體.

目前，觀察葉片氣孔形貌的儀器主要有光學顯微鏡[3-4]、掃描電鏡[5-6]、共聚焦顯微鏡[7-8]等.用普通光學顯微鏡觀察氣孔是最常用的方法，觀察氣孔的數(shù)量和分布簡單易行，但是受光學衍射極限的限制，極限分辨率只能達300 nm左右，無法看清氣孔表面的細節(jié).利用掃描電鏡可以清晰地看到氣孔的形貌，但是樣品制作過程復雜且必須在真空中成像，而氣孔被觀察時已經(jīng)處于失活狀態(tài)，既無法觀察氣孔的動態(tài)過程，圖像也會有一定程度的失真.

原子力顯微鏡AFM觀察植物葉片氣孔，制樣簡單，分辨率可以達到10 nm，遠高于環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM).可直接將樣品黏附于云母、石墨、玻片等平整的基底表面進行掃描，還可以在近生理狀態(tài)下對樣品進行成像.由于AFM的這些獨特優(yōu)勢，已有很多研究應用它來探討各種生物過程，但是目前尚未見到直接利用活體材料通過AFM觀察葉片氣孔超微結構的報道.筆者采用AFM振蕩模式[9-10]研究芥藍葉片氣孔表面及其周圍的超微結構，并對氣孔在溫度升高過程中的形態(tài)變化進行動態(tài)觀察.

AFM 是利用光杠桿原理產(chǎn)生的光束偏轉技術研制而成的[9].在一個對形變極為敏感的微懸臂(cantilever)的一端安裝納米級的針尖，掃描時樣品和針尖存在力的相互作用，使微懸臂產(chǎn)生形變，導致從針尖背面反射到四象限檢測器的激光束發(fā)生微弱變化，繼而產(chǎn)生電壓差，最后將這些電壓信號轉換為圖像.用于分析的模式有接觸模式(contact mode)和振蕩模式(tapping mode)兩種.使用接觸模式進行掃描時，針尖與樣品相互接觸，所成圖像具有較高的分辨率，通常用來檢測樣品的物理屬性，由于剪切力的存在，對樣品有一定損傷，很少用于探測生物樣品.振蕩模式是靠聲學或磁力驅(qū)動，針尖和樣品只有短暫接觸，作用力較小，常用于生物樣品成像[10].

1 材料與方法

選取新鮮芥藍葉片，上表皮朝上，用無菌蒸餾水沖洗兩遍后，切成2 cm×2 cm的小方塊，通過雙面膠將小方塊固定于蓋玻片上，將蓋玻片放置于AFM的樣品臺上留待觀察.

將蓋玻片置于 AFM(Cpresearch，Thermomicroscopes，USA)樣品臺上，利用監(jiān)視器將探針定位在葉片上任意平坦區(qū)域.樣品在Tapping模式下觀察，懸臂針尖曲率半徑為10 nm，力常數(shù)約為2.8 N/m，室溫下觀察，掃描速率1 Hz.AFM圖像僅經(jīng)過平滑處理(Thermomicroscopes，Proscan Image Processing Software Version 2.11軟件)，利用軟件的線分析功能，對圖像進行剖面高度曲線的分析.

2 結 果

用AFM對樣品進行大范圍的掃描，得到圖1-a所示掃描范圍為100 μm×100 μm的高度圖，高度圖以灰度值的高低表示物體高度的變化，灰度值越高(越接近白色)表示高度越高，灰度值越低(越接近黑色)表示高度越低，圖片正中間是一個張開的氣孔，氣孔的周圍分布著圓形或長條形的表皮細胞.圖1-b是同一位置的振幅圖，振幅圖比高度圖更形象地反映出物體的形態(tài)特征.

圖1 芥藍葉片表皮的AFM圖像Fig.1 The AFM image of epidermis of cabbage mustard， scanning area

對樣品進行進一步的局部掃描可以得到氣孔的放大圖(圖2-a、圖2-c)，通過放大，得到氣孔的形貌特征，可以清楚地分辨氣孔由左右兩個半月形的保衛(wèi)細胞組成，環(huán)繞著保衛(wèi)細胞的是兩個副衛(wèi)細胞，這種氣孔構成方式為平軸式.圖2-b是三維圖，三維圖可以從各個角度觀察物體，可以得到更形象的結果.圖2-d是圖2-a中黑色剖面線所示的氣孔高度曲線圖，從曲線圖中可以得到氣孔張開處的最大距離為2.1 μm，保衛(wèi)細胞的高度約為1 μm.

圖2 張開的氣孔AFM圖像Fig.2 AFM image of an open stoma

隨著觀察時間的推移，張開的氣孔蒸騰作用強烈，葉片所含水分不斷降低，保衛(wèi)細胞也開始失去水分，氣孔開始閉合.圖3-a所示為氣孔開始閉合時候的圖像，從圖3-c中可以得到氣孔的張開徑度變?yōu)榱?.9 μm，但保衛(wèi)細胞的高度并沒有變化，由于保衛(wèi)細胞失去了部分水分，保衛(wèi)細胞表面略微有皺縮出現(xiàn).所以氣孔的張開、閉合是靠保衛(wèi)細胞改變自身的彎曲程度造成的.

圖3-b是圖3-a的三維重建圖，利用在三維軟件里的燈光設置，更清晰地看到圖3-a里不甚明顯的覆蓋在副衛(wèi)細胞上的微纖維結構，這些纖維的直徑約為400 nm，間隔為200 nm左右.

圖3 閉合的氣孔AFM圖像Fig.3 AFM image of a close stoma

通過AFM直接進行活體葉片氣孔的觀察，不但較好地保持了細胞原來的形態(tài)，而且還可以進行動態(tài)觀察，并獲取氣孔的微觀結構圖像，包括保衛(wèi)細胞、副衛(wèi)細胞以及用普通方法很難觀察到的覆蓋在副衛(wèi)細胞上的微纖維結構等.AFM不僅可以研究細胞的二維或三維形貌和表面微觀結構，甚至還可以研究細胞的彈性、粘度和力學性質(zhì)等.不僅可以研究細胞的靜態(tài)結構，還可以研究細胞的動態(tài)過程.所有這些均有待于AFM技術的發(fā)展、成熟和普及，以及在生物研究上的應用進展.

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