韓珊珊，貝麗霞，陳祥梅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2.淄博市國(guó)家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)招商局）

防風(fēng)（Saposhnikovia divaricata）為傘形科防風(fēng)屬多年生藥用草本植物[1]，由于掠奪式采挖、草原開(kāi)荒等原因，野生資源遭到嚴(yán)重破壞，造成了野生防風(fēng)資源逐年減少與藥材市場(chǎng)對(duì)防風(fēng)需求量卻與日俱增的供求矛盾[2，3]。采用植物組織培養(yǎng)的方法生產(chǎn)藥用植物，具有不受地區(qū)、季節(jié)與氣候限制，便于工廠(chǎng)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，且組織培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)速度比植物正常生長(zhǎng)的速度快[4，5]。

目前關(guān)于防風(fēng)的研究主要在植物資源、化學(xué)成分、中藥鑒定、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面[6，7]，有關(guān)防風(fēng)的體外培養(yǎng)，有人曾用幼葉誘導(dǎo)愈傷組織分化出根芽[8]，也有人用原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株[9]。但關(guān)于培養(yǎng)基、激素組合、光照、愈傷誘導(dǎo)周期和繼代培養(yǎng)次數(shù)防風(fēng)植株再生的影響尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)防風(fēng)不定芽分化的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2007～2009年，于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料為防風(fēng)的愈傷組織。愈傷組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室前期研究（韓珊珊，2009）[10]：取無(wú)菌苗的幼葉，切成0.5～1.0 cm的小方塊，置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，即MS+NAA0.6+KT0.5+6-BA1.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基對(duì)不定芽的分化的影響

在誘導(dǎo)出的愈傷組織繼代培養(yǎng)25 d左右時(shí)，選擇生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，切割成直徑為0.5 cm左右的方塊，分別接種于MS，1/2MS，B5和White基本培養(yǎng)基，研究培養(yǎng)基對(duì)不定芽的分化的影響。每處理接種4瓶，每瓶接5塊愈傷組織，統(tǒng)計(jì)芽高大于0.5 cm的不定芽總數(shù)。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.2 激素組合對(duì)不定芽的分化的影響

在誘導(dǎo)出的愈傷組織繼代培養(yǎng)25 d左右時(shí)，選擇生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，切割成直徑為0.5 cm左右的方塊，分析細(xì)胞分裂素 6-BA（0.5，1.5，2.5，3.5，4.5 mg·L-1），KT（0.2，0.4，0.6，0.8 mg·L-1）分別與生長(zhǎng)素 NAA（0.2，0.4，0.6 mg·L-1）配合使用對(duì)防風(fēng)分化培養(yǎng)的影響。按二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每處理組合接種4瓶，每瓶接5個(gè)愈傷組織，40 d后統(tǒng)計(jì)芽高大于0.5 cm的不定芽總數(shù)。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。計(jì)算不定芽的分化率，并對(duì)分化率進(jìn)行方差分析。

另一方面，將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織接種于同時(shí)添 加 3 種 激 素 NAA （0，0.2，0.4，0.6 mgL-1）、KT（0，0.2，0.5，0.8 mg·L-1）和 6-BA（0，1.0，1.5，2.0 mg·L-1）的培養(yǎng)基上，按L16（43）方案做三因素四水平正交試驗(yàn)。每處理組合接種4瓶，每瓶接5個(gè)愈傷組織，40 d后統(tǒng)計(jì)芽高大于0.5 cm的不定芽總數(shù)。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.3 光照強(qiáng)度對(duì)不定芽的分化的影響

分別在光照 12 h·d-1，光照強(qiáng)度為 5001 x、10001 x、20001 x、30001 x 和黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，研究光照強(qiáng)度對(duì)不定芽的分化的影響。

1.3.4 愈傷誘導(dǎo)周期和繼代次數(shù)對(duì)不定芽的分化的影響

在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+NAA0.6+KT0.5+6-BA1.0上對(duì)防風(fēng)葉片外植體愈傷進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)。其他條件相同的情況下，分別在繼代培養(yǎng)15、25、35、45 d時(shí)轉(zhuǎn)接，研究培養(yǎng)間隔時(shí)間對(duì)防風(fēng)出芽分化的影響，每個(gè)處理接種30個(gè)芽苗，重復(fù)2次，接種后觀察記錄芽的長(zhǎng)勢(shì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

不定芽分化率=（形成不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%

數(shù)據(jù)記錄分析由DPS3.01軟件完成

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)不定芽的分化的影響

從表1中可知，MS培養(yǎng)基為最合適的培養(yǎng)基，其芽誘導(dǎo)率最好，芽發(fā)生時(shí)間最短。B5培養(yǎng)基獲得較高的誘導(dǎo)率，芽發(fā)生時(shí)間僅次于MS，White培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最低，芽發(fā)生時(shí)間最長(zhǎng)。

表1 培養(yǎng)基類(lèi)型對(duì)防風(fēng)不定芽分化率的影響Table 1 Effects of substrate types on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

2.2 激素組合對(duì)不定芽的分化的影響

細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)有很大的影響，不同的植物間其濃度配比都存在差異。只有適宜的濃度組合，才能獲得較高的誘導(dǎo)率并且植株生長(zhǎng)健壯。

將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織接種到含激素的MS培養(yǎng)基40 d，對(duì)兩種細(xì)胞分裂素6-BA和KT分別與生長(zhǎng)素NAA配合使用的二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，見(jiàn)表2和表3。總體來(lái)看，不論與哪種細(xì)胞分裂素配合，在供試的3個(gè)生長(zhǎng)素濃度下，隨著生長(zhǎng)素濃度的升高，防風(fēng)不定芽的分化率呈現(xiàn)減低的趨勢(shì)。同時(shí)在生長(zhǎng)素濃度為0.4和0.6 mg·L-1的條件下，防風(fēng)愈傷不定芽的分化率隨著6-BA濃度的增加而增加，不過(guò)高濃度6-BA對(duì)不定芽分化的影響較小。值得注意的是，在生長(zhǎng)素濃度為0.2 mg·L-1和6-BA為2.5 mg·L-1的配比情況下，防風(fēng)愈傷的分化率達(dá)到最大的53.1%；在生長(zhǎng)素濃度為0.2 mg·L-1和KT為0.4 mg·L-1的配比情況下，防風(fēng)愈傷的分化率達(dá)到最大的56.0%。

表2 激素組合配比對(duì)防風(fēng)不定芽分化率的影響%Table 2 Effects of hormone combination on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表3 激素組合配比對(duì)防風(fēng)不定芽分化率的影響%Table 3 Effects of hormone combination on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表4，表5激素組合的三因素四水平實(shí)驗(yàn)對(duì)防風(fēng)不定芽分化形成率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：NAA，KT對(duì)愈傷組織不定芽的分化作用達(dá)極顯著水平，其極差分別達(dá)到了16.25和10.19；6-BA對(duì)愈傷愈傷組織芽分化作用不顯著。從實(shí)驗(yàn)的16個(gè)處理看出：處理6為適合防風(fēng)愈傷組織芽分化的最佳處理組合，即MS+NAA0.2+KT0.2+6-BA1.0的不定芽分化率最高，達(dá)60.1%。

表4 愈傷組織不定芽分化的正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Effects of hormone combination on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表5 愈傷組織不定芽分化的正交試驗(yàn)的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test on callus adventitious bud differentiation

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)不定芽分化的影響

由表6可以看出：隨著光照強(qiáng)度的增加從5001 x到20001 x，愈傷組織產(chǎn)生的芽數(shù)增加，叢生芽健壯。但當(dāng)光強(qiáng)度增加到30001 x，愈傷組織開(kāi)始褐化死亡，可見(jiàn)光照太強(qiáng)不利于防風(fēng)愈傷的生長(zhǎng)。在光照強(qiáng)度為20001 x，光照時(shí)間為12 h的條件下，適合防風(fēng)愈傷組織分化出苗。

2.4 培養(yǎng)周期和繼代次數(shù)對(duì)不定芽分化的影響

其他條件相同的情況下，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)防風(fēng)不定芽的質(zhì)量和再生能力都有很大的影響，繼代時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不利于防風(fēng)芽的分化。由表7可以看出：愈傷繼代培養(yǎng)25 d和35 d的防風(fēng)不定芽分化率相近，都達(dá)到60%左右，綜合比較繼代培養(yǎng)25 d為宜。隨著繼代次數(shù)的不斷增加，仍是25 d和35 d為周期的處理防風(fēng)不定芽的分化率較高。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)愈傷老化，褐化，時(shí)間過(guò)短愈傷分化不完全，都將影響芽分化。然后對(duì)25 d和35 d不同培養(yǎng)周期的防風(fēng)愈傷進(jìn)行繼代次數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)繼代次數(shù)以25 d為周期的繼代2次、3次差異不顯著，從實(shí)驗(yàn)成本等綜合方面考慮，培養(yǎng)周期25 d、繼代次數(shù)2次可有效提高防風(fēng)不定芽的分化。

表6 光照強(qiáng)度對(duì)防風(fēng)不定芽分化率的影響Table 6 Effects of klx on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表7 培養(yǎng)周期和繼代次數(shù)對(duì)防風(fēng)不定芽分化率的影響Table 7 Effects of culture period and the number of subcultureon Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

3 結(jié)論

3.1 MS+NAA0.2+KT0.2+6-BA1.0為適合防風(fēng)愈傷組織芽分化的最佳培養(yǎng)基。

3.2 光照強(qiáng)度為20001 x，光照時(shí)間為12 h的條件下，最適合防風(fēng)愈傷分化出苗。

3.3 防風(fēng)愈傷繼代培養(yǎng)周期25 d，繼代培養(yǎng)2次能有效提高防風(fēng)不定芽的分化。

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