黃新蘭 李雪蘭 季紅蘭

江蘇省揚子江藥業(yè)集團有限公司（225321）

頭孢克洛片臨床主要用于治療呼吸道、泌尿道和皮膚組織感染以及中耳炎[1]等，該藥物對革蘭陰性菌和陽性菌都具有抗菌作用。本文采用了多種方法消除該藥物的抗菌活性，按要求將5株試驗菌：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉加入頭孢克洛片中。細菌采用離心沉淀加薄膜過濾法，霉菌、酵母菌采用常規(guī)法，控制菌宜采用離心沉淀、培養(yǎng)基稀釋加薄膜過濾法，對各試驗菌的回收率進行逐一驗證，從而建立了頭孢克洛片的微生物限度的檢查方法。

1 儀器與試藥

HTY-2000A型智能集菌儀（泵速設為160r/min）、HTY-K型培養(yǎng)器專用振蕩儀、HTY型反復使用全封閉集菌培養(yǎng)器 （杭州高得泰林生物技術設備有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海索普儀器有限公司）、KA-1000型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

試驗菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]（均來源于中國藥品生物制品檢定所，傳種代數(shù)為第3代）。

膽鹽乳糖培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基（均來源于北京三藥科技開發(fā)公司）、pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（揚子江藥業(yè)集團有限公司輸液制劑車間配制）；頭孢克洛片（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號08052501、08053001、08053002規(guī)格：0.25g）。

2 方法[2-4]與結(jié)果

2.1 菌液的制備

將上述菌種按2005年版《中國藥典》二部 附錄Ⅺ J菌液制備方法制成所需濃度的菌懸液和孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品5g，加入約45℃的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，保溫振搖使混勻，作為1∶20的供試液。

取1∶20的供試液10mL至離心管中，以500轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清液至另一離心管中，加pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補至10mL，混勻，作為離心后1∶20的供試液。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌檢查方法的驗證

2.3.1 細菌檢查方法的驗證

試驗組：取離心后1∶20的供試液，注入反復使用全封閉集菌培養(yǎng)器（含有100mL的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）中，振搖過濾，用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗300mL（50mL/次），在最后一次沖洗液中分別加入50～100cfu的菌懸液，取出濾膜，菌面朝上置相應的培養(yǎng)基貼膜培養(yǎng)，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定的時間，逐日觀察結(jié)果，測定供試品本底菌數(shù)。

表1 微生物驗證方法試驗結(jié)果（回收率%）

表2 大腸埃希菌控制菌驗證方法試驗結(jié)果

菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數(shù)。

供試品對照組：照試驗組制備項下操作，不加菌懸液，作為供試品本底菌數(shù)。

稀釋劑對照組：取45℃的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，取10mL至離心管中，以500轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清液至另一離心管中用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補至10mL，混勻，用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗300mL（50mL/次），在最后一次沖洗液中分別加入50～100cfu的菌懸液，取出濾膜，菌面朝上置相應的培養(yǎng)基貼膜培養(yǎng)，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定的時間，逐日觀察結(jié)果。

2.3.2 霉菌和酵母菌檢查方法的驗證

試驗組：取1∶20的供試液各1mL，注入平皿中，在每個平皿中分別加入1mL菌懸液，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，混勻，凝固，于23～28℃倒置培養(yǎng)，以72h點計菌落數(shù)。

菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數(shù)。

供試品對照組：照試驗組制備項下操作，不加菌懸液，作為供試品對照組。

將上述細菌培養(yǎng)皿置于30～35℃倒置培養(yǎng)48h；霉菌及酵母菌培養(yǎng)皿置于23～28℃倒置培養(yǎng)72h，分別點計菌落數(shù)并記錄。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

供試液的制備：同“2.2”離心后1∶20的供試液。

試驗組：取離心后1∶20的供試液20mL，至250mL pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖過濾，然后用300mL 45℃pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液振蕩沖洗，每次50mL，在最后一次過濾液中加入10～100cfu的大腸埃希菌菌懸液，過濾后取出濾膜，置250mL錐形瓶中，加入約200mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，于35～37℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。

陰性菌對照組：取上述1∶20的離心供試液20mL，至100mL pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖過濾，然后用300mL 45℃pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液振蕩沖洗，每次50mL，在最后一次過濾液中加入10～100cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液，過濾后取出濾膜，置250mL錐形瓶中，加入約200mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，于35～37℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。

陽性對照試驗：取大腸埃希菌菌懸液1mL，置250mL錐形瓶中，加入約200mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，于35～37℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。

陰性對照試驗：取pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液20mL，置250mL錐形瓶中，加入約200mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，于35～37℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。

檢查：取上述試驗液的培養(yǎng)物各0.2mL，接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。

2.5 驗證結(jié)果

見表1和表2。

3 討 論

方法驗證所用菌株選擇的原則：選擇代表性、 普遍性、低或非致病性的標準菌株（或該藥品中常見的污染菌）。菌種的要求：傳代不得超過 5代，采用適宜的方法保存，應防止變異。菌液濃度也是影響方法驗證的一個重要因素，濃度應適中，控制在50～100cfu，實際工作中，發(fā)現(xiàn)試驗用的50～100cfu菌液對溫度比較敏感，過高的溫度影響菌液的活性，造成菌回收率的不準確性，進而影響方法的確定。所以在操作中應采用當日新鮮制備的菌液，并注意周圍環(huán)境溫度的控制。

本品是具有強抗菌作用的抗生素，經(jīng)多次試驗，細菌宜采用離心沉淀加薄膜過濾法；霉菌、酵母菌采用常規(guī)法；控制菌宜采用離心沉淀、培養(yǎng)基稀釋加薄膜過濾法，以消除抑菌活性。薄膜過濾所用的沖洗量以200、300、400mL進行研究驗證，最后確定 300mL沖洗量可達完全消除抑菌活性的作用，菌回收率均可達標。

[1]中華人民共和國藥典臨床用藥須知[S].2005年版.化學藥和生物制品卷.

[2]李惠娥,張丹,由亞寧,等.14種化學藥品微生物限度檢查方法驗證結(jié)果及分析[J].西北藥學雜志,2007,22(6):325-327.

[3]李惠娥,由亞寧,衷紅梅,等.復方頭孢克洛顆粒微生物限度檢查方法的探討[J].藥物分析雜志,2007,27(7):1086-1088.

[4]中國藥典[S].2005年版.二部.附錄93-98.