張 輝 ，喻莉萍 ，李 旭 ，胡吉林 ，何志雄 ，林應(yīng)標(biāo) ，劉巧突 ，李強(qiáng)國(guó)

（1.湘南學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系藥學(xué)教研室，湖南郴州 423000；2.湘南學(xué)院圖書(shū)館，湖南郴州 423000；3.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南郴州 423000）

La(C7H5O3)2·(C9H6NO)是將七水氯化鑭與水楊酸、8-羥基喹啉反應(yīng)合成的鑭與水楊酸、8-羥基喹啉三元混合配合物，為一種人工合成的稀土配合物。水楊酸是常用的抗感染藥物[1]，喹啉衍生物則具有較好的抗菌、抗腫瘤作用[2]，稀土和許多生物分子有親和力，并能參與重要的生命過(guò)程，對(duì)多種酶或酶原具有激活或抑制作用，有明顯的抗菌活性[3]。我室最近的研究顯示，該配合物具有抗真菌和細(xì)菌的作用[4]，也具有促細(xì)胞凋亡作用[5]。然而La(C7H5O3)2·(C9H6NO)促凋亡的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)探討La(C7H5O3)2·(C9H6NO)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響及其作用機(jī)制，旨在闡明La(C7H5O3)2·(C9H6NO)是否通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞周期而選擇性地誘導(dǎo)凋亡以抑制細(xì)胞增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，七水氯化鑭（上海試劑公司，分析純），水楊酸（上海試劑公司，分析純），8-羥基喹啉（上海試劑公司，分析純），AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒為北京寶賽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，RPMI 1640 培養(yǎng)基為 GIBCO-BRL（Grand Island，NY，USA）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)溶液的 配制 將 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)溶于 DMSO溶液中，配制成 1 g/L的母液，貯存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 Hel a細(xì)胞的培養(yǎng)條件[6]Hela細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、50 ml/L CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活細(xì)胞數(shù)超過(guò)95%，在含1%胎牛血清的RPMI 1640中饑餓培養(yǎng)24 h后，于培養(yǎng)瓶中分別加入含不同實(shí)驗(yàn)濃度的 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)（0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L）的培養(yǎng)液，分別在24 h及48 h換同樣濃度的加藥培養(yǎng)液，以未加La(C7H5O3)2·(C9H6NO)干預(yù)的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.3 MTT法測(cè)定La(C7H5O3)2·(C9H6NO)對(duì)Hel a細(xì)胞增殖活性的影響 根據(jù)以往文獻(xiàn)[7]，96孔板細(xì)胞接種密度為每孔2×103個(gè)，24 h 后加入實(shí)驗(yàn)濃度 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)培養(yǎng)液，選擇 570 nm 波長(zhǎng)，在加藥前和加藥后 24、48、72、96 h分別測(cè)定光吸收值A(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率。生長(zhǎng)率=（A處理細(xì)胞-A未處理細(xì)胞）/A未處理細(xì)胞×100%。 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值進(jìn)行分析。

1.2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞傳代24 h后，在含1%胎牛血清的RPMI 1640中饑餓培養(yǎng)24 h后，加入實(shí)驗(yàn)濃度的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)培養(yǎng)液，72 h后收集細(xì)胞，根據(jù)以往文獻(xiàn)方法[8]檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行分析。

1.2.5 Annexi nⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)[9]收集La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用72 h的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 000個(gè)/L，PBS洗滌2次，取1 ml細(xì)胞懸液按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行凋亡檢測(cè)。AnnexinⅤ陽(yáng)性且PI陰性判斷為早期凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，經(jīng)SPSS 12.0軟件分析，采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 La(C7H5O3)2·(C9H 6NO)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

5.0 、10.0 μmol/L 的 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理 72 h 后，Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活性開(kāi)始受到抑制；處理96h后，1.0μmol/L的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)也能抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活性。結(jié)果表明，隨著La(C7H5O3)2·(C9H6NO)濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用顯著增強(qiáng)，呈濃度及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響（x±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of La(C 7H5O3)2·(C9H6NO)in different times on the growth rate of Hela cells(x±s,%)

2.2 La(C7H5O3)2·(C9H 6NO)對(duì)細(xì)胞周期的影響

Hela 細(xì)胞經(jīng) La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用 72 h 后，1.0、5.0、10.0μmol/L組G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，S期細(xì)胞數(shù)量下降，與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 Hela細(xì)胞經(jīng)La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理72 h后細(xì)胞周期的變化（x±s，%）Tab.2 Changes in cell cycle of Hela cells treated with La(C7H5O3)2·(C9H6NO)for 72 hours(x±s,%)

2.3 AnnexinⅤ-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用 96 h 后，1.0、5.0、10.0 μmol/L La(C7H5O3)2·(C9H6NO)組的凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 AnnexinⅤ-FITC檢測(cè)La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用96 h后的Hela 細(xì)胞凋亡率的變化（x±s，%）Tab.3 Apoptotic rate of Hela cells treated with La(C7H5O3)2·(C9H6NO)for 96 hours detected by AnnexinⅤ-FITC staining(x±s,%)

3 討論

許多用于癌癥化療的細(xì)胞毒藥物最終的共同的作用機(jī)制都是引起細(xì)胞凋亡。各種不同作用靶點(diǎn)的藥物可通過(guò)激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，最后導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[10-12]。

本研究結(jié)果表明，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)對(duì) Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，隨著藥物濃度由0.5μmol/L增至10.0μmol/L及作用時(shí)間由24 h增至96 h，Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用顯著加強(qiáng)，呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性。細(xì)胞周期分析顯示，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理后 G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加，S期細(xì)胞數(shù)量顯著下降，表明 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)可使 Hela細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

由以上結(jié)果可以推斷，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)除具有促凋亡作用外，還能抑制細(xì)胞分裂，可能提示La(C7H5O3)2·(C9H6NO)誘導(dǎo)的凋亡和細(xì)胞周期阻滯是通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制介導(dǎo)的，哪一種途徑占優(yōu)勢(shì)取決于細(xì)胞特異的信號(hào)通路（細(xì)胞類(lèi)型特異性）和信號(hào)受影響的程度（藥物劑量依賴(lài)性）?；谏鲜龈鞣N原因，在經(jīng)過(guò)La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理后，如果對(duì)凋亡信號(hào)的影響超過(guò)了對(duì)細(xì)胞周期信號(hào)的影響，則細(xì)胞將產(chǎn)生凋亡。反之，則引起細(xì)胞周期的阻滯；隨著細(xì)胞周期阻滯的延長(zhǎng)，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但這是通過(guò)不同的、間接的信號(hào)事件啟動(dòng)的，是細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯引起的結(jié)果?？傊?，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制細(xì)胞增殖。

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