康金鳳,胡漢華,陳 蓉,武貴臻,杜同心,丁智慧,賀曉燕

棘球蚴寄生于人體所引起的疾病稱棘球蚴病或包蟲病。包蟲病是嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。包蟲病的治療,目前仍以手術(shù)治療為主。尋找有效的非手術(shù)的治療方法是我們的研究目標(biāo)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式,是由外界因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)部死亡機(jī)制,最終導(dǎo)致的細(xì)胞自身毀滅,在細(xì)胞毀滅的過(guò)程中,一般不伴有炎癥反應(yīng)〔1〕,是一種理想的殺蟲方式。有關(guān)寄生蟲學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞調(diào)亡,相關(guān)學(xué)者已在醫(yī)學(xué)原蟲、醫(yī)學(xué)蠕蟲方面做了一些研究〔2〕,但是目前尚未見棘球蚴內(nèi)原頭節(jié)自身產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的報(bào)道。原頭節(jié)是棘球蚴的重要組成部分,并且在完成該蟲生活史中起著不可替代的作用;原頭節(jié)還在組織結(jié)構(gòu)上與棘球蚴有許多相同或相似之處〔3-4〕。本文觀察了棘球蚴內(nèi)原頭節(jié)自身是否存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象和探索了原頭節(jié)發(fā)生細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原頭節(jié) 采自新疆烏魯木齊屠宰場(chǎng)當(dāng)日宰殺的新疆綿羊的肝臟或肺臟的細(xì)粒棘球蚴。將長(zhǎng)有棘球蚴的臟器表面消毒后,分離、暴露出棘球蚴。用無(wú)菌注射器盡量吸出棘球蚴中囊液和游離的原頭節(jié)。手術(shù)摘除棘球蚴囊壁并在吸出的囊液中涮洗以收集殘留的原頭節(jié)和小育囊。備用。

1.1.2 試劑 兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)(編號(hào)為BS-0169R)、兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)(編號(hào)為 BS-0081R),美國(guó)ZYMED過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素(SP)染色試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒,均購(gòu)自北京博奧森生物公司。TUNEL(原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記)細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒為凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 普通顯微鏡觀察 直接吸取采集出來(lái)的原頭節(jié)于載玻片,蓋上蓋玻片即可用不同倍數(shù)顯微鏡觀察。

1.2.2 免疫組化檢測(cè) 按文獻(xiàn)〔5〕方法制作原頭節(jié)組織切片。Caspase-1與caspase-3抗體濃度按1∶300稀釋。切片經(jīng)高壓熱修復(fù),其余均按試劑盒說(shuō)明操作。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色,蘇木素復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下觀察。caspase-1與caspase-3均以細(xì)胞漿(可包括細(xì)胞核)被染成棕黃色為陽(yáng)性,無(wú)黃染者為陰性。另以PBS代替Ⅰ抗以排除假陽(yáng)性。

1.2.3 T UNEL檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明操作。原頭節(jié)用4%中性甲醛固定24～48 h后,先后用瓊脂糖和石蠟包埋原頭節(jié),制作厚4 μ m的組織切片。經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染后,顯微鏡觀察。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被T UNEL試劑染成棕黃色,正常細(xì)胞核不著色,正常細(xì)胞核可被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色。

1.2.4 透射電鏡觀察 收集的原頭節(jié)用無(wú)菌生理鹽水洗滌1次,用4%戊二醛前固定24 h,再用1%鋨酸后固定、丙酮梯度脫水、Epon812環(huán)氧樹脂包埋后,用瑞典LKB-2188超薄切片機(jī)切成60nm厚,鉛鈾電子染色,日本JEOL1230透射電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 普通顯微鏡觀察 直接采集原頭節(jié)用顯微鏡觀察,可見一些原頭節(jié)結(jié)構(gòu)清晰、完整,透光性良好,鈣顆粒清亮而明顯(圖1-箭頭所指);一些原頭節(jié)體積縮小,透光性降低,鈣顆粒變小或模糊不清,呈現(xiàn)枯萎征象(圖1-紅邊框箭頭所指)。

圖1 顯微鏡觀原頭節(jié)形態(tài)(×400)Fig.1 Morphology of protoscolex under microscope(×400)

2.2 免疫組化檢測(cè) 在收集的原頭節(jié)中,在同一張切片,甚至同一個(gè)育囊中,一些原頭節(jié)很少或幾乎無(wú)caspase-1、caspase-3表達(dá)(圖2、圖 3之 箭頭所指),一些原頭節(jié)則呈現(xiàn)極強(qiáng)的caspase-1、caspase-3表達(dá)(圖2、圖3之紅邊框箭頭所指)。而PBS代替Ⅰ抗者,所有原頭節(jié)都呈陰性反應(yīng),由此也排除了假陽(yáng)性。

2.3 TUNEL檢測(cè) 用TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在上述caspase-1、caspase-3強(qiáng)表達(dá)的原頭節(jié)中同樣檢測(cè)到了大量調(diào)亡細(xì)胞(圖4之紅邊框箭頭所指)。檢測(cè)結(jié)果與caspase蛋白表達(dá)高度一致。

圖4 TUNEL檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Result detected by TUNEL assay

2.4 透射電鏡觀察 在收集的原頭節(jié)中,正常原頭節(jié)體被合胞體帶向外長(zhǎng)有排列整齊的微毛,微毛外側(cè)有較厚的PAS陽(yáng)性物質(zhì),原頭節(jié)內(nèi)部實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈圓形或橢圓形,細(xì)胞核大而明顯,核仁居中,核內(nèi)染色質(zhì)比較細(xì)膩,異染色質(zhì)較少(圖5-A)。除正常原頭節(jié)之外,還見到了典型細(xì)胞凋亡形態(tài)改變的原頭節(jié),表現(xiàn)為原頭節(jié)皮層微毛外PAS陽(yáng)性物質(zhì)消失,內(nèi)部實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)濃縮,并可見凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡特征性改變(圖5-B、C)。

圖5 原頭節(jié)的透射電鏡觀察Fig.5 Observation on protoscolexby transmission electron microscope

3 討 論

凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)(缺口),暴露出大量3′羥基末端,如用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(-dUTP)進(jìn)行缺口末端標(biāo)記,則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞,此即原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)——TUNEL法〔6〕。T UNEL法是一種將分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡時(shí)典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征,不僅可用于從培養(yǎng)細(xì)胞和組織中分離的凋亡細(xì)胞的形態(tài)鑒定,亦可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片等。TUNEL法可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞,因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用〔7〕。本文用 T UNEL法對(duì)自然狀態(tài)原頭節(jié)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有些原頭節(jié)存在不同程度的細(xì)胞凋亡。

迄今為止,透射電鏡仍然為最經(jīng)典、可靠的判定細(xì)胞凋亡的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下可清晰地觀察到細(xì)胞凋亡的特征性的超微結(jié)構(gòu)改變:如凋亡細(xì)胞體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮;核染色質(zhì)凝聚、邊緣化,呈新月形;胞質(zhì)緊實(shí),細(xì)胞器集中,胞膜起泡;凋亡晚期的細(xì)胞核裂解為碎塊,形成凋亡小體或可見凋亡小體被鄰近巨噬細(xì)胞吞噬的現(xiàn)象,等〔7〕。本文在自然狀態(tài)原頭節(jié)中見到有的原頭節(jié)呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮和凋亡小體形成等典型細(xì)胞凋亡改變,進(jìn)一步證明棘球蚴原頭節(jié)自身存在細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。

Caspase-1、caspase-3是細(xì)胞凋亡在執(zhí)行階段起中心作用的兩個(gè)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶。Caspase-1即白介素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ICE),與線蟲自殺基因蛋白(CED-3)是同源物,其一級(jí)結(jié)構(gòu)與CED-3有28%的同源性,可發(fā)揮與CED-3相似的作用。Caspase-3即相對(duì)分子質(zhì)量32 000的半胱氨酸蛋白酶(CPP32),是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶。未活化的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Pro-caspase-3)與 CED-3有 35%同源,是 caspase家族中與CED-3同源性最高的,不論結(jié)構(gòu)同源性還是底物特異性,都與 CED-3相似〔8〕。所以有人認(rèn)為它是CED-3在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。另外,有報(bào)道認(rèn)為檢測(cè) caspase-3可用來(lái)區(qū)分細(xì)胞死亡的兩種形式——凋亡與漲亡,認(rèn)為caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮核心作用,而在漲亡細(xì)胞中呈陰性表達(dá)〔9〕。關(guān)于棘球絳蟲細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不清楚。本文利用免疫組化技術(shù),選用能與多種哺乳動(dòng)物起交叉反應(yīng)的caspase-1、caspase-3的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè),并用PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照,以排除假陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果在以上T UNEL法檢測(cè)陽(yáng)性的自然狀態(tài)原頭節(jié)中檢測(cè)到caspase-1和caspase-3明顯表達(dá)。這不僅進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡的存在,也提示原頭節(jié)中存在與ced-3類似的細(xì)胞凋亡基因。

作者已經(jīng)在體外成功地用過(guò)氧化氫〔10〕和地塞米松聯(lián)合 AT P〔11〕誘導(dǎo)棘球蚴原頭節(jié)發(fā)生細(xì)胞凋亡,并在被誘導(dǎo)的原頭節(jié)中檢測(cè)到caspase-3活性明顯增高。本文又觀察到棘球蚴原頭節(jié)在宿主體內(nèi)自身產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。進(jìn)一步搞清原頭節(jié)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的機(jī)制,將為治療包蟲病新方法的探索提供理論依據(jù)。

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