龔家明,羅勇,蔣開夫,劉毅

1.安康市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西 安康725000;2.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,重慶400016

電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation,FNS)對局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷有保護作用,其機制尚未完全闡明[1,2]。核因子-κ B(nuclear factor kappa-B,NF-κ B)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子,激活后可誘導多種下游靶基因表達,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallproteinases,MMP-9)是其中重要的一種。MMP-9可攻擊和破壞血-腦脊液屏障,導致腦卒中后血管源性腦水腫,并對神經(jīng)元有一定毒性。本實驗通過觀察FNS對局灶性腦缺血再灌注后大鼠腦組織NF-κ B和MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達的影響,探討FNS的中樞神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:健康雄性Wistar大鼠40只,體質(zhì)量250～300 g,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。②主要試劑與材料:羊抗大鼠NF-κ B/P65和MMP-9單克隆抗體、免疫組化試劑盒(購于北京中杉生物公司);雙極同心圓電極(直徑100 μ m,重慶醫(yī)科大學生理學教研室提供);引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型制備及分組 所有大鼠隨機分為正常對照(normal control,NC)組、缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)組、電刺激小腦齒狀核(dentate nucleus stimulation,DNS)組和FNS組各10只。NC組不予任何處理,其余3組制作局灶性腦缺血再灌注模型(缺血2 h后再灌注24 h)[3]。術(shù)中出血較多、呼吸困難、取腦時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血及提前死亡者剔除,并補足相應(yīng)例數(shù)。動物蘇醒后參考Longa等[4]的評分法評分,2分或2分以上者入選本實驗。

1.2.2 DNS和FNS 3.5%水合氯醛1 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠后固定于腦立體定向儀上,沿顱骨中線剪開頭皮,暴露前囟,根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜進行核團定位。小腦齒狀核定位于前囟后11.6 mm,左旁開 3.0 mm,深度6.5 mm;小腦頂核定位于前囟后11.6 mm,左旁開1.1 mm,深度5.6 mm。鉆開顱骨后,插入雙極同心圓電極,予強度 50 μ A 、頻 率 70 Hz、時程 0.5 ms 的電刺激 。DNS組再灌注同時DNS 1 h;FNS組再灌注同時FNS 1 h。在電刺激過程中維持動物始終處于淺麻醉狀態(tài)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測NF-κ B/P65和MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 再灌注24 h后,提取各組大鼠腦組織總RNA并定量,DNAase I處理總RNA去除DNA污染后,各實驗組取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR。NF-κ B/P65引物正義鏈:5'-TGCACCTAGCTGCCAAAGAAGGA-3',反義鏈:5'-TCTGCTCCTGCTGCTT TGAGAA-3',產(chǎn)物長度293 bp。內(nèi)參β-actin引物正義鏈:5'-TCACCATCTTCCAGGAGGGA-3',反 義 鏈:5'-CACAATGCCGAAGTCGTCGT-3',產(chǎn)物長度376 bp。MMP-9引物正義鏈:5'-AGGCTACAGCTTTGCTGCCCC-3',反義鏈:5'-GCTGCTTCTGAAGCATCAGCA-3',產(chǎn)物長度194 bp。內(nèi)參β-actin引物正義鏈:5'-CTGGTGGACAACATCGCTCT-3',反義鏈:5'-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3',產(chǎn)物長度349 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,58℃復性30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)35次;72℃延伸7 min;4℃終止反應(yīng)。取PCR擴增產(chǎn)物5 μ L行瓊脂糖凝膠(20 g/L)電泳,電壓80 V,紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相。Quantity One-4.4.0軟件行半定量分析,以目的基因與β-actin條帶平均光密度比值表示目的基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.4 免疫組織化學法檢測 NF-κ B/P65和MMP-9蛋白表達 再灌注24 h后,4%多聚甲醛灌注固定大鼠,斷頭取腦。冠狀切取視交叉后部腦組織,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片脫蠟、水化,30 g/L H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶,蒸鎦水洗滌3次,滴加正常血清封閉液,室溫孵育20 min,不同切片分別滴加適量 NF-κ B/P65和MMP-9抗體,4℃濕盒孵育過夜。滴加生物素化二抗,37℃孵育20 min,滴加鏈霉親合素-生物素-過氧化氫酶復合物37℃孵育20 min。DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片。每只大鼠取三張切片,400×放大倍數(shù)下,每張切片隨機取5個視野,Image-pro plus 5.0圖像分析軟件測定計算平均光密度值(optical density,OD)。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(±s)表示,方差齊性資料采用F檢驗,方差非齊性資料采用秩和檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果 與NC組相比,I/R組、DNS組和 FNS組 NF-κ B/P65及 MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均增高(P＜0.05),FNS組 NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較I/R和DNS組降低(P＜0.05),DNS組與 I/R 組比較 NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異,見圖1、圖2及表 1。

2.2 免疫組織化學檢測結(jié)果 NF-κ B/P65陽性細胞胞漿黃染,NC組可見少量NF-κ B/P65陽性細胞;I/R組和DNS組NF-κ B/P65陽性細胞較NC組增多(P＜0.05),且胞漿、胞核均黃染;FNS組NF-κ B/P65陽性細胞較I/R組和DNS組減少(P＜0.05);I/R組和DNS組比較差異無統(tǒng)計學意義。MMP-9陽性細胞胞漿黃染,NC組可見少量MMP-9陽性細胞;I/R組和DNS組MMP-9陽性細胞較NC組增多,呈強陽性表達(P＜0.05);FNS組MMP-9陽性細胞較 I/R組和 DNS組減少(P＜0.05);I/R組和DNS組比較差異無統(tǒng)計學意義,見圖3A-D、圖4A-D及表2。

表1 各組大鼠NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

表1 各組大鼠NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

與NC組比較,①P＜0.05;與FNS組比較,②P＜0.05

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表2 各組大鼠的NF-κ B/P65、MM P-9蛋白表達平均OD值比較(±s)

表2 各組大鼠的NF-κ B/P65、MM P-9蛋白表達平均OD值比較(±s)

與NC組比較,①P＜0.05;與FNS組比較,②P＜0.05

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3 討論

NF-κ B屬于Rel蛋白家族成員,可組成同源或異源二聚體,是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。靜息狀態(tài)下,NF-κ B處于失活狀態(tài),在胞漿內(nèi)與NF-κ B抑制因子(inhibitor of factor kappa B,Iκ B)結(jié)合,被激活后與Iκ B解離,轉(zhuǎn)入核內(nèi)與特定DNA序列結(jié)合,調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。腦缺血再灌注后,NF-κ B被氧自由基、細胞因子、鈣超載等因素刺激活化后誘導細胞因子、粘附分子、炎性酶類、凋亡基因的表達,促進氧自由基形成,加重鈣超載,造成腦缺血損傷[5]。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一,主要作用于血管基底膜成份,可降解血管周圍基膜主要成份IV型明膠膠原、層粘連蛋白、纖粘連蛋白等,與腦缺血后血-腦脊液屏障的破壞密切相關(guān)。MMP-9是NF-κ B的下游靶基因之一,腦缺血后,活化的NF-κ B進入核內(nèi)啟動MMP-9的mRNA轉(zhuǎn)錄,MMP-9蛋白合成明顯增加,通過蛋白水解作用破壞毛細血管緊密連接和基底膜,導致血-腦脊液屏障崩潰,加重腦水腫,加快炎性細胞浸潤及神經(jīng)細胞死亡,加重缺血性腦損傷[6-8]。Rosenberg等[9]發(fā)現(xiàn),大鼠大腦中動脈閉塞 2 h后,MMP-9表達增高,24 h達高峰,持續(xù) 5 d,與腦水腫的發(fā)生、發(fā)展時間規(guī)律一致。本實驗顯示,缺血再灌注后24 h,NF-κ B和MMP-9的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達增加。

研究顯示,FNS可增加局部腦血流,減輕興奮性神經(jīng)毒性作用,保護神經(jīng)組織,減輕腦水腫,促進神經(jīng)功能恢復。本實驗結(jié)果顯示,FNS可下調(diào)腦缺血再灌注后NF-κ B和MMP-9的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達,DNS對腦缺血再灌注后NF-κ B、MMP-9表達水平無明顯作用,提示FNS可能通過抑制NF-κ B激活和減少其表達,下調(diào)其下游MMP-9的表達,減輕腦缺血后血-腦脊液屏障的破壞和腦水腫,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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