梅愛農(nóng),王玨,楊心青,程瓊,雷慧新,楊津,朱鵬立

福建省立醫(yī)院 a.干部特診一科,b.兒科,c.耳鼻喉科,d.神經(jīng)內(nèi)科,福州 350001

嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)具有成鞘和促進(jìn)軸突再生作用,在以脫髓鞘為主要病理改變的自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)及多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)的治療中有一定應(yīng)用價值。目前國內(nèi)外對有關(guān)OECs的免疫原性及移植免疫的研究幾乎空白,本實驗首次檢測OECs的主要組織相容性抗原(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)分子及髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、髓鞘含脂質(zhì)蛋白(myelin proteolipid protein,PLP)、髓鞘結(jié)合糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)等鞘膜抗原蛋白的表達(dá)情況,為OECs移植后可能面臨的免疫反應(yīng)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:新生1～2 d健康 Wistar大鼠,由福建省立醫(yī)院動物實驗中心提供。②主要試劑與材料:胎牛血清(購于杭州四季青公司),DMEM/F12培養(yǎng)基(購于 GIBCO公司),鼠抗NGFRp75(購于武漢博士德公司),兔抗MBP和兔抗MAG(購于上海晶天公司),兔抗PLP(購于Abcam公司),熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記抗 MHC-I(FITC-anti-MHC-I)和熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記抗MHC-II(FITC-anti-MHC-II)(購于BD Pharmingen公司),流式細(xì)胞儀(購于Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 OECs的培養(yǎng) 取新生1～2 d健康Wistar大鼠嗅球加入 0.125%胰酶2 mL于37℃消化15 min,移入離心管,吹打成OECs單細(xì)胞懸液,1200 r/min離心6 min,棄上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為 1×106/mL,接種于玻璃培養(yǎng)瓶(未包被),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一玻璃培養(yǎng)瓶(未包被)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)瓶(多聚右旋賴氨酸包被),根據(jù)細(xì)胞生長情況每2～3 d半量換液,細(xì)胞長滿瓶底后傳代,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。

1.2.2 OECs鑒定及 MBP、MAG、PLP分子檢測

OECs細(xì)胞爬片經(jīng)漂洗、4%多聚甲醛室溫固定后,5%Triton室溫作用30 min,正常羊血清室溫封閉20 min,不同爬片分別加適量NGFRp75、MBP、MAG及PLP一抗4℃孵育過夜,加生物素化二抗,37℃孵育20 min,加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,37℃孵育15 min,以上各步驟結(jié)束時均須PBS沖洗3次,DAB顯色,PBS沖洗終止反應(yīng),常規(guī)脫水、透明、封片、鏡下觀察并照相。每張爬片隨機計數(shù)10個非重疊視野(×200),分別計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),計算陽性細(xì)胞比例。

1.2.3 OECs體外培養(yǎng)細(xì)胞MHC-I與MHC-II的表達(dá) 收集OECs,制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度至 5×106/mL,取 4 管 ,每管 50 μ L,加入1 ∶20 滅活正常兔血清,4℃封閉30 min,取其中2管分別加入FITC-anti-MHC-I和 FITC-anti-MHC-II各10 μ L,另外2管不加抗體作相應(yīng)對照,4℃避光孵育30 min,PBS洗2次,流式細(xì)胞儀檢測,EXPO32TM ADC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

OECs在接種時細(xì)胞呈圓形,折光性好,6 h后開始貼壁生長;3 d時細(xì)胞以梭形為主,胞體發(fā)亮,兩端發(fā)出纖細(xì)突起,見圖1A;5～6 d時大部分細(xì)胞呈雙極或三極,其特征為細(xì)長的突起,見圖1B;9～10 d時細(xì)胞長滿瓶底,排列方向不一,細(xì)胞間相互交聯(lián)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示,87%細(xì)胞NGFRp75陽性,為OECs細(xì)胞,見圖1C。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的OECs表面高表達(dá)MHC-I分子(78.4±4.45)%,中等表達(dá) MHC-II分子(43.2±2.98)%,見圖2A-B。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示,OECs細(xì)胞上未見 MBP、MAG、PLP分子表達(dá),見圖3A-C。

3 討論

細(xì)胞的免疫原性主要取決于其表面MHC分子的表達(dá)情況。細(xì)胞移植時,受者的免疫細(xì)胞如抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)、CD4+Th1(T helper,Th)及CD8+TCL(T cell lines,TCL)細(xì)胞能直接或間接識別移植細(xì)胞表面的MHC-II、MHC-I類分子[1]。CD8+TCL細(xì)胞能結(jié)合MHC-I類分子,啟動細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致移植細(xì)胞死亡,CD4+Th1細(xì)胞能結(jié)合MHC-II類分子,活化的Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-2、干擾素-γ及淋巴毒素,促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞的發(fā)育成熟,通過遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity,DTH)及抗體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)[1]。此外,MHC分子尚能直接導(dǎo)致吞噬細(xì)胞的吞噬和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)穿孔素殺傷。本實驗發(fā)現(xiàn),來源于嗅球的OECs高表達(dá)MHC-I類分子,中等表達(dá) MHC-II類分子,一旦這種細(xì)胞異體或異種移植,高表達(dá)的MHC-I類分子能被受者的CD8+TCL以及非特異免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞直接識別,導(dǎo)致細(xì)胞死亡;同時存在的MHC-II類分子可能激發(fā)受者CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的DTH,導(dǎo)致排斥反應(yīng)的最大化和慢性排斥,這可能是目前異體或異種OECs移植效果不盡人意的原因之一。

自體OECs的培養(yǎng)成功[2]給OECs自體移植帶來希望。這種移植用于諸如脊髓損傷的治療時,無需考慮移植排斥問題,但如果用于MS等這類自身免疫性脫髓鞘疾病的治療,同樣存在自身免疫排斥的問題。MS發(fā)病的分子模擬學(xué)說認(rèn)為,某些病毒蛋白的抗原決定簇(表位)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘抗原相類似,病毒抗原可以激活反應(yīng)性T細(xì)胞誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答,不僅能與病毒抗原反應(yīng),也可產(chǎn)生針對自身組織-髓鞘抗原的交叉免疫反應(yīng)。在EAE模型中,給易感動物皮下注射髓鞘蛋白成分,如MBP、PLP135-151、MOG35-55伴完全弗氏佐劑,可誘發(fā)與MS相似的CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性脫髓鞘病[3]。因此,移植細(xì)胞是否表達(dá)MBP、PLP、MOG等髓鞘蛋白是MS等疾病移植治療成功的關(guān)鍵。本實驗發(fā)現(xiàn),來源于嗅球的OECs表面并不表達(dá)MBP、MAG、PLP等重要的髓鞘蛋白。目前國內(nèi)外有關(guān)這方面的研究極少,個別研究指出,OECs與脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元或嗅球組織混合培養(yǎng),OECs會聯(lián)絡(luò)神經(jīng)元并合成鞘磷脂如MBP,但單獨培養(yǎng)條件下或提高培養(yǎng)基中cAMP濃度,均不能誘導(dǎo)OECs的MBP合成[4],提示這種具有成鞘潛力的細(xì)胞似乎處于一種不成熟的狀態(tài),僅當(dāng)其在一定的培養(yǎng)環(huán)境尤其是與神經(jīng)元取得聯(lián)系后才會啟動相關(guān)基因,促進(jìn)髓鞘蛋白乃至髓鞘的合成。對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)移植鼠脫髓鞘模型的研究提示,僅當(dāng)處于炎性環(huán)境下,OPCs才能與受損神經(jīng)元的軸突取得聯(lián)系,此過程通常以0.2 mm/周的速度自脫髓鞘周邊向中心區(qū)遷徙[5]。假設(shè)OECs以同樣方式遷徙,首先其僅會與炎性區(qū)神經(jīng)元獲得聯(lián)絡(luò),因而避免在遷徙過程中受到免疫攻擊,其次因為遷徙過程極度緩慢,OECs也在相當(dāng)長時間內(nèi)因為缺乏MBP等重要髓鞘蛋白而免受自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的攻擊,從而相對“免疫赦免”,提示OECs在移植之初不大可能受到自身免疫系統(tǒng)的攻擊。

總之,盡管OECs由于存在一定程度的MHC分子表達(dá),在異種或同種異體移植中可能面臨一定程度的免疫排斥,但由于其缺乏髓鞘相關(guān)蛋白如MBP、PLP、MAG等,在自體移植治療包括脊髓損傷(甚至自身免疫性疾病如MS)等疾病中有一定的應(yīng)用前景。

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