鄧璞紅,張?jiān)Ｆ?魏新軍

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

三聚氰胺最早被李比希于1834年合成,是一種重要的有機(jī)化工產(chǎn)品,主要用來(lái)制作三聚氰胺樹(shù)脂,其具有優(yōu)良的耐水性、耐熱性、耐電弧性、優(yōu)良阻燃性,與食品、飼料毫不相干,但由于三聚氰胺（含氮量66%）與蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）相比含有更高比例的氮原子,所以被一些造假者利用,添加在食品中以造成蛋白質(zhì)含量較高的假象,從而造成諸如2007年美國(guó)寵物食品污染事件和2008年中國(guó)毒奶粉事件等嚴(yán)重的食物安全事故.2010年2月1日,未銷(xiāo)毀的含三聚氰胺的問(wèn)題奶粉被重新包裝或加工成各種乳制品、雪糕等制品進(jìn)行銷(xiāo)售,對(duì)人們的健康和生命造成巨大危害和威脅.國(guó)際上早在20世紀(jì)80年代就已注意到食品中三聚氰胺對(duì)動(dòng)物的毒害,并相繼研究了一系列方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),目前對(duì)三聚氰胺的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有以下3類(lèi)[1]:反相液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法.在常規(guī)液相基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的微流液相與常規(guī)分析型液相相比有以下優(yōu)點(diǎn)[2]:樣品用量少；流動(dòng)相中有機(jī)溶劑消耗少,對(duì)環(huán)境友好；柱效率高,分析時(shí)間短；可直接與質(zhì)譜聯(lián)用等.因此,本試驗(yàn)首次探索了μ-HPLC法測(cè)定奶粉中三聚氰胺,該方法樣品處理簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便.

1 材料與方法

1.1 材料

乙腈（色譜純,＞99.9%）、甲醇（色譜純,＞99.9%）、環(huán)己烷（色譜純,＞99.9%）、1%三氯乙酸（分析純,＞99.0%）購(gòu)至天津科密歐化學(xué)試劑科技有限公司；苯代三聚氰胺（優(yōu)級(jí)純,＞99%）購(gòu)至New.Jersey.USA；辛烷磺酸鈉（色譜純,＞99.9%）購(gòu)至百靈威化學(xué)試劑有限公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（分析純,＞99.0%）購(gòu)至天津市博迪化工有限公司；檸檬酸（分析純,＞99.5%）購(gòu)至天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；甲苯（分析純,＞99.5%）購(gòu)至洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；二次水（自制）；伊利袋裝奶粉購(gòu)于超市.

離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Agilent1100型高效液相色譜儀；紫外檢測(cè)器配在柱毛細(xì)管檢測(cè)池（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司）；N2000色譜數(shù)據(jù)處理軟件（浙江智達(dá)信息工程公司,浙江大學(xué)）；彈性石英毛細(xì)管柱（河北省永年銳灃色譜器件有限公司）；裝柱機(jī)（大連日普利科技儀器有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 流速:0.9 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm,進(jìn)樣量:20 μL,柱溫:室溫,流動(dòng)相:離子對(duì)緩沖液/乙腈=60/40（V/V）,離子對(duì)緩沖液組成:10 mmol/L檸檬酸,10 mmol/L辛烷磺酸鈉,調(diào)pH至3.0,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾,備用.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg三聚氰胺加入到100 mL的容量瓶?jī)?nèi),用甲醇/水（3/7,V/V）的溶劑定容,配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,然后稀釋成濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的系列溶液,1.2 mg/mL的另行配制,然后各自加入相同質(zhì)量的內(nèi)標(biāo)物苯代三聚氰胺,使其濃度為0.4 mg/mL,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾,備上機(jī)用.

1.2.3 樣品處理 稱(chēng)取奶粉2 g（7份）分別放入7個(gè)50 mL的容量瓶中,量取甲醇/水（3/7,V/V）溶劑45 mL,搖勻,加入5 mL三氯乙酸（沉淀蛋白用）,超聲振蕩10 min,靜置.之后8 000 r/min離心10 min,收集上清液,用濾紙粗慮后,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾,備上機(jī)用[3-5].

2 毛細(xì)管柱制備

毛細(xì)管首先經(jīng)NaOH、HCl、H2O預(yù)處理過(guò)程[6],然后截取50 cm預(yù)處理過(guò)的空管,參考制備MPTMS為單體基質(zhì)的毛細(xì)管電色譜整體柱的有關(guān)配方[7-10],采用溶膠凝膠技術(shù)制備一臨時(shí)塞子,將5 μm的ODS硅膠填料用高壓勻漿法在60 MPa下進(jìn)行裝填,填裝過(guò)程中將毛細(xì)管浸入到超聲波容器中超聲震蕩,填好后在特定位置燒結(jié)一出口塞,然后用甲醇反沖洗出口塞后的填料,小心取下毛細(xì)管,在離毛細(xì)管出口端8.5 cm處,燒去聚酰亞胺涂層約2 mm,制得檢測(cè)窗口.通過(guò)分離四種模型化合物硫脲、苯、甲苯、乙苯進(jìn)行性能評(píng)價(jià),并與同樣長(zhǎng)度的商品化柱相比，柱效更高,能夠滿足微流液相法三聚氰胺的檢測(cè).

圖1 自組裝微流液相色譜儀

3 微流液相系統(tǒng)的建立

本試驗(yàn)對(duì)常規(guī)液相色譜儀進(jìn)行了改裝,進(jìn)樣后通過(guò)四通分流器分別連接分離毛細(xì)管和分流毛細(xì)管.樣品經(jīng)過(guò)分流之后,不會(huì)超載,另外通過(guò)選用合適長(zhǎng)度和內(nèi)徑的毛細(xì)管可以調(diào)節(jié)分離毛細(xì)管的背壓,并且可以在毛細(xì)管管內(nèi)獲得理想的流速,采用的分流毛細(xì)管長(zhǎng)度為1 m（2根）,內(nèi)徑分別為100、75 μm.圖1為改造后的微流液相色譜系統(tǒng)的裝置.

4 結(jié)果與討論

4.1 色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)采用自制的反相C18色譜柱,經(jīng)過(guò)評(píng)價(jià)與表征后,色譜柱性能良好,重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均可用于實(shí)際樣品分析檢測(cè).

分流管的選擇:為了不使壓力過(guò)大對(duì)輸液泵造成損害,也不至于壓力太低延遲樣品出峰時(shí)間,分別試驗(yàn)了50、75、100 μm不同組合的空毛細(xì)管做分流管,最終選擇75、100 μm各1 m長(zhǎng)的空管做分流管.

試驗(yàn)分別考察不同流動(dòng)相比例緩沖液/乙腈從90/10～30/70（V/V）,流速?gòu)?.5～1.2 mL/min的變化對(duì)分離效果的影響,經(jīng)比較,選定流動(dòng)相比例為60/40（V/V）,流速為0.9 mL/min作為實(shí)際樣品測(cè)定條件.

4.2 標(biāo)準(zhǔn)圖譜與方法重現(xiàn)性測(cè)定

用濃度為0.4 mg/mL的溶液連續(xù)進(jìn)樣11次,標(biāo)準(zhǔn)圖譜和重疊圖譜如圖2a、2b所示,三聚氰胺的平均出峰時(shí)間為2.698 min,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%,峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.58%,苯代三聚氰胺的平均出峰時(shí)間4.03 min,RSD為0.26%,相對(duì)峰面積Ai/As的RSD為1.15%,以上數(shù)據(jù)表明此方法的重現(xiàn)性良好.

圖2 a 標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖2 b 重疊圖譜

4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度從低到高依次進(jìn)樣檢測(cè),以三聚氰胺與內(nèi)標(biāo)物苯代三聚氰胺的峰面積比值為縱坐標(biāo),以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示.在系列濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為:Y=1.324 2X+0.047 5,R=0.996 0.

4.4 樣品測(cè)定及回收率計(jì)算

采用市售伊利奶粉進(jìn)行試驗(yàn),純奶粉樣品未檢測(cè)到三聚氰胺,2 g的模擬奶粉樣品中檢測(cè)到0.5 mg三聚氰胺,因此采用加入內(nèi)標(biāo)物苯代三聚氰胺進(jìn)行樣品測(cè)定,并計(jì)算回收率.分別進(jìn)行三個(gè)水平0.4、0.6、0.8 mg/mL的加標(biāo),各進(jìn)樣5次,回收率在87%～105%,平均回收率93.25%,各個(gè)水平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.04%～1.6%,上述數(shù)據(jù)顯示采用內(nèi)標(biāo)法輔助定量具有更好的線性和準(zhǔn)確性.圖4a、4b分別是純奶粉樣品、模擬樣品圖譜.

圖3 標(biāo)準(zhǔn)工作直線

圖4 a 純奶粉樣品

圖4 b 模擬樣品

5 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)常規(guī)液相色譜儀進(jìn)行了改裝,采用雙分流技術(shù)利于靈活調(diào)整背景壓力,操作簡(jiǎn)便,與商品化的微流液相系統(tǒng)相比,經(jīng)濟(jì)適用,并且可以達(dá)到環(huán)保的目的；奶粉樣品采用三氯乙酸沉淀蛋白,經(jīng)過(guò)兩次過(guò)濾后去除了干擾基質(zhì)；用離子對(duì)緩沖液與乙腈做流動(dòng)相提高了分離的選擇性,苯代三聚氰胺做內(nèi)標(biāo)物提高了方法的精度；方法在三聚氰胺濃度為0.1～1.2 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,該方法為實(shí)驗(yàn)室微流液相測(cè)定三聚氰胺提供了一種依據(jù).

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