程 悅，吳文玉，苗愛清，徐索文，龐 式，王鐵橋，劉培慶，王冬梅

(1.中山大學藥學院， 廣東 廣州 510006；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所， 廣東 英德 513000)

茶葉中含有多種酚類抗氧化成分，已有研究證明茶多酚類成分有抗動脈粥樣硬化的作用[1-3]，并對α-葡萄糖苷酶有抑制作用[4]。同一茶鮮葉在各種茶的獨特的加工過程中，茶葉中原有的化學成分分別發(fā)生著不同的變化，形成了不同發(fā)酵類型茶的各自獨特的風味品質(zhì)，同時也使它們在藥理活性上表現(xiàn)出不同的特點。烏龍茶、紅茶、黑茶分別為半發(fā)酵茶、發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶。為了比較這3種不同發(fā)酵茶在降糖降脂抗動脈粥樣硬化活性上的差異，本論文以白葉單樅茶同一季節(jié)、同一標準采摘的茶鮮葉為原料，按照傳統(tǒng)加工工藝，分別制成烏龍茶、紅茶、黑茶，對它們的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性和對Raw264.7巨噬細胞泡沫化形成的抑制活性進行了研究比較。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采摘秋季白葉單樅一芽三、四葉及同等嫩度的對莢葉后，按照如下方法分別加工制成烏龍茶、紅茶和黑茶。

烏龍茶：茶鮮葉→曬青→涼青→做青(4次)→殺青→揉捻→毛火→足火→揀梗、黃片→茶樣。

紅茶：茶鮮葉→萎凋→揉切→篩分→發(fā)酵→毛火→足火→撈篩→茶樣。

黑茶：茶鮮葉→攤青→殺青→揉捻→曬干→發(fā)水漚堆→翻堆(6次)→晾→烘干→篩分→揀?！铇?。

各種茶樣粉碎后過40目篩，置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶(Saccharomycesp. )(日本和光公司)，葡萄糖測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，阿卡波糖(北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司)。小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞株由中山大學公共衛(wèi)生學院凌文華教授饋贈。健康人新鮮血漿購自中山大學第一附屬醫(yī)院血液科，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)自制。RPMI-1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)，胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司)，四甲基噻唑藍(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG6000)、酶學熒光法檢測膽固醇試劑盒、抗生素(青、鏈霉素)、麥芽糖、兒茶素均購自美國Sigma 公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

酶聯(lián)免疫檢測儀ELK-800型(Bio-Tek)，超速離心機Optima LE-80K(BECKMAN COULTER)，Centrifuge5417R(Eppendorf)，超聲細胞破碎儀(Branson Digital Sonifier)，TU-1810紫外可見分光光度計。

1.3 茶水提物的制備

將茶葉粉末置于燒杯中，加入10倍量的水，超聲20 min后，再置于沸水浴中20 min，脫脂棉過濾，茶渣再重復提取一次。合并2次水提液，濃縮至干，備用。

1.4 茶多酚和茶色素的含量測定

茶多酚采用酒石酸亞鐵比色法，茶黃素、茶紅素和茶褐素采用系統(tǒng)分析法[5]。

1.5 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

取3種茶的水提取物適量分別溶于生理鹽水，配成50 μg/mL的供試茶樣溶液。取供試茶樣溶液20 μL，與2 μL 20 unit/mL α-葡萄糖苷酶溶液混合，在37 ℃搖床中振搖10 min后，加入20 μL 0.05 mol/L的麥芽糖溶液，37 ℃搖床中繼續(xù)振搖10 min。以上反應在96孔培養(yǎng)板上完成，采用葡萄糖氧化酶法(葡萄糖測定試劑盒測定)，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm下測定吸光度值(A值)，以葡萄糖的生成量，計算α-葡萄糖苷酶抑制活性；以α-糖苷酶抑制劑阿卡波糖為陽性對照藥物，同時設(shè)定空白對照和陰性對照。

1.6 對巨噬細胞Raw264.7泡沫化的抑制作用研究

1.6.1 對巨噬細胞Raw264.7增殖的影響 采用噻唑蘭(MTT)法測定各茶水提物在不同濃度下對巨噬細胞增殖的影響。

1.6.2 對巨噬細胞Raw264.7泡沫化的影響

1)細胞處理：在六孔板接種細胞，置37℃、φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞完全貼壁。換無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入新鮮的無血清培養(yǎng)液，再加入不同濃度的各種茶水提物，模型組加入同體積的PBS，培養(yǎng)2 h。加入刺激因素ox-LDL使其終濃度為50 μg/mL，培養(yǎng)24 h。正常對照組(空白組)以同體積的培養(yǎng)基代替ox-LDL。

2)細胞內(nèi)膽固醇及蛋白質(zhì)含量的測定：實驗結(jié)束后，以5 000 r/min離心10 min，棄上清收集細胞，PBS洗滌2次。加入0.1 mL異丙醇，超聲破碎3次，每次15 s，靜置120 min。取15 μL樣品加入到135 μL總膽固醇(TC)分析液(0.1 U/mL膽固醇氧化酶、1 U/mL過氧化酶、0.010 U/mL膽固醇酯酶、φ=0.05% Triron X-100、1 mmol/L膽酸鈉、0.6 g/mLp-苯乙醇酸)中，37 ℃孵育1 h，熒光分光光度計檢測熒光強度，激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長為410 nm。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定用Lowry法。細胞內(nèi)的總膽固醇含量用每克細胞蛋白質(zhì)所含的TC含量來表示，采用單位蛋白的熒光讀數(shù)A值作為TC含量的比較指標。各茶葉提取物對巨噬細胞泡沫化的抑制率按照如下公式計算

2 結(jié)果與分析

2.1 白葉單樅不同發(fā)酵茶中茶多酚和茶色素的含量

如表1所示，茶多酚含量(w)從高到低依次為烏龍茶 > 紅茶 > 黑茶；茶黃素和茶紅素含量(w)以紅茶最高，黑茶最低，它們是紅茶茶湯主要的橙黃色色素；茶褐素含量(w)以黑茶最高，約為烏龍茶、紅茶中含量的2.5倍，說明黑茶在渥堆中形成大量茶褐素，而其它成分則大量減少，其對黑茶茶湯紅褐色品質(zhì)的形成有著至關(guān)重要的作用，是黑茶獨特的品質(zhì)成分。

表1 白葉單樅不同發(fā)酵茶茶多酚和茶色素的含量

Table 1 Contents of tea polyphenols, theaflavins, thearubigins and theabrownines in different fermented tea products prepared fromCamelliasinensisvar.baiyedancong

烏龍茶紅茶黑茶w(茶多酚)/%36.1321.8312.33w(茶黃素)/%0.280.480.21w(茶紅素)/%7.589.033.47w(茶褐素)/%5.485.5713.77

2.2 白葉單樅不同發(fā)酵茶對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖1可見，3種不同發(fā)酵茶對α-葡萄糖苷酶的抑制活性從強到弱依次為紅茶>黑茶>烏龍茶，預示較深度的發(fā)酵過程或微生物后發(fā)酵過程有利于具有α-葡萄糖苷酶抑制活性物質(zhì)的生成。各個藥物組與空白對照組相比達到極顯著差異水平(P<0.01)，且3種茶的組間差異也達到極顯著差異水平(P<0.01)。

圖1 不同發(fā)酵茶對α-葡萄糖苷酶的抑制活性與對照相比**P<0.01

2.3 白葉單樅不同發(fā)酵茶對Raw264.7巨噬細胞泡沫化的抑制作用

2.3.1 不同發(fā)酵茶水提物對巨噬細胞的細胞毒性

由表2可見，隨著茶水提物質(zhì)量濃度的升高，細胞的存活率降低，3種茶水提物質(zhì)量濃度在低于100 μg/mL時對細胞無明顯毒性，細胞存活率較高。因此選用茶水提物質(zhì)量濃度為50和100 μg/mL來進行后續(xù)對巨噬系Raw264.7細胞泡沫化抑制活性的比較研究。

表2 不同發(fā)酵茶對Raw264.7細胞的細胞毒性1)

2.3.2 不同發(fā)酵茶水提物對Raw264.7巨噬細胞泡沫化的抑制活性 由圖2可見，3種不同發(fā)酵茶水提物對Raw264.7巨噬細胞泡沫化都表現(xiàn)出一定程度的抑制作用。在水提物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，3種茶的抑制活性無明顯差別，抑制率在35%～37%之間，紅茶組和黑茶組與對照組相比達到顯著差異水平(P<0.05)，3種茶葉組間并無顯著差異(P>0.05)；而當水提物質(zhì)量濃度提高為100 μg/mL時，黑茶表現(xiàn)出最強的抑制活性，其抑制率達到73.29%，紅茶和烏龍茶對Raw264.7巨噬細胞泡沫化的抑制率分別為62.31%和51.93%，3種茶葉組均與對照組相比達到顯著差異水平(P<0.05)，且其組間差異也達到顯著差異水平(P<0.05)。

圖2 不同發(fā)酵茶對Raw264.7巨噬細胞泡沫化抑制作用的比較與對照相比*P<0.05

3 討 論

烏龍茶的加工通過搖青使葉緣摩擦損傷，茶葉僅部分“發(fā)酵”，故稱為半發(fā)酵茶；紅茶由于在加工過程中，鮮葉充分利用了其內(nèi)生酶的生物化學作用，使茶多酚發(fā)生一系列的反應，又稱全發(fā)酵茶；黑茶經(jīng)殺青后再堆悶，多酚類成分在微生物的作用下發(fā)生氧化、聚合，形成后發(fā)酵茶。茶葉中的多酚類成分的含量與其發(fā)酵程度負相關(guān)，本論文測得不同發(fā)酵茶的茶多酚含量(w)烏龍茶>紅茶>黑茶，而茶褐素在黑茶中的含量遠高于烏龍茶和紅茶。

3種茶水提物對α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，但發(fā)酵程度較高的紅茶和黑茶的活性較烏龍茶高，預示茶色素類成分可能是其抑制活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。抑制α-葡萄糖苷酶活性，可以有效地抑制食物中碳水化合物的水解和消化，延緩葡萄糖的吸收，從而有效地阻止糖尿病患者餐后血糖的升高，α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為降糖藥物新藥研發(fā)的一個重要靶標。近年來有研究指出，有抗氧化作用的物質(zhì)可以減輕與糖尿病相關(guān)的病理損傷，從而起到防治糖尿病的作用[6]。因茶葉中含的多酚類物質(zhì)均具有較強的抗氧化作用，所以α-葡萄糖苷酶可能只是茶葉發(fā)揮降糖作用的其中一個靶點，其他的作用靶點還有待進一步研究。

動脈粥樣硬化(AS)是嚴重危害人類健康的常見病，巨噬細胞無限制地攝取氧化脂質(zhì)進而形成泡沫細胞是其早期病變的重要環(huán)節(jié)[7]。因此, 這種巨噬細胞泡沫化被認為是治療動脈粥樣硬化的新靶標[8]。本論文探討比較了3種不同發(fā)酵茶對抑制Raw264.7巨噬細胞泡沫化的影響，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，黑茶水提物的抑制活性最高，且與未經(jīng)ox-LDL刺激的正常巨噬細胞的總膽固醇含量較為接近，預示黑茶中含量最高的茶褐素類成分可能是其抑制巨噬細胞泡沫化的有效成分，其具體作用機制有待于進一步深入研究。

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