王玉軍，紀(jì)偉東，李永平

（黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院糧油工程系，哈爾濱 150080）

大豆低聚糖(Soybean Oligosaccharides，SBOS)是大豆籽粒中可溶性寡糖的總稱，也可泛指其它豆科作物種子所含有的低聚糖總稱，主要成分是蔗糖（Sucrose）、棉子糖（Raffinose）、水蘇糖（Stachyose）。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖以α-1，2糖苷鍵結(jié)合而成。而棉子糖和水蘇糖則是在蔗糖結(jié)構(gòu)中的葡萄糖之C6位以α-1，6糖苷鍵又分別結(jié)合了1分子和6分子的半乳糖，其均屬于非還原性糖。其中棉子糖和水蘇糖為功能性低聚糖，其功能特性主要表現(xiàn)在：促進(jìn)雙歧桿菌的增值，減少有毒發(fā)酵產(chǎn)物及有害細(xì)菌酶的產(chǎn)生，防止腹瀉和便秘，改善血清脂質(zhì)，保護(hù)肝功能，降低血壓，增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤，合成維生素，防齲齒，低能量或無能量[1]。

大豆低聚糖的測定方法有很多種，其中較準(zhǔn)確的方法是氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。這兩種方法都具有既可定性又可定量的優(yōu)點(diǎn)。其中HPLC法不但分離效果好，重現(xiàn)性及回收率均比GC法好[2]。利用HPLC測定SBOS方法也有許多報(bào)道[3]，如利用carbohydrate色譜柱測定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉籽糖[3]，及選用Hypersil-NH2色譜柱測定方法[4，5]、μBondapak—C18柱測定方法[6]、反相液相色譜法(RP-HPLC)[7]等方法，本文對采用carbohydrate色譜柱的HPLC方法同時(shí)測定大豆低聚糖粉中水蘇糖和棉子糖的方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該方法靈敏、準(zhǔn)確、可行。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：Agilent1100型高效液相色譜儀、示差折光檢測器(G13162A RID)、Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6×150mm,5μm)、SUPELCLEAN ENVI-18化學(xué)工作站。

試驗(yàn)試劑：水蘇糖、棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司色譜純產(chǎn)品；乙腈為色譜純；大豆低聚糖粉購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6×150mm,i.d.5μm)；流動相為乙腈-水(75∶25,V∶V)；流速1mL/min；柱溫30℃；RID檢測器，檢測池溫度35℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取水蘇糖、棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量均≥98%）各0.02g置于5mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻。水蘇糖、棉子糖溶液濃度分別為4mg/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。

1.4 樣品制備

準(zhǔn)確稱取2.00g大豆低聚糖粉，用去離子水溶解并稀釋定容至100mL，混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。

1.5 測定方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取大豆低聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 5.0μL、10.0μL、15.0μL、20.0μL、25.0μL（相當(dāng)于水蘇糖、棉子糖質(zhì)量20μg、40μg、60μg、80μg、100μg）注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜分析，測定各組分色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)糖質(zhì)量對相應(yīng)的峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 樣品測定 在相同的色譜分析條件下，取10μL試樣溶液注入高效液相色譜儀分析，測定各組分色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較確定進(jìn)樣液中水蘇糖、棉子糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

采用示差折光檢測器，采用carbohydrate色譜柱，同時(shí)對大豆低聚糖粉中的水蘇糖、棉子糖進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果表明，選用carbohydrate色譜柱進(jìn)行檢測效果較好。

2.2 流動相的選擇

本實(shí)驗(yàn)以乙腈-水為流動相，通過改變乙睛與水的比例優(yōu)化色譜條件。以乙腈-水分別為80∶20、75∶25、70∶30(V∶V)測定了混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和大豆低聚糖中棉子糖、水蘇糖含量和分離情況。實(shí)驗(yàn)表明，隨著乙腈濃度的增加，糖蜜中的糖分離程度提高，當(dāng)流動相中乙腈和水的比例為80∶20時(shí)分離效果最佳，但是分離時(shí)間較長。當(dāng)流動相中乙腈和水的比例為70∶30時(shí)分離效果不好，葡萄糖和相鄰峰的分離度較差。當(dāng)流動相中乙腈和水的比例為75∶25時(shí)分離效果很好，且保留時(shí)間較理想。綜合考慮各個(gè)因素,本實(shí)驗(yàn)采用流動相的比例為75∶25。

2.3 色譜分離

采用上述分析條件，柱溫選定為30℃，棉子糖和水蘇糖分離良好，兩者的保留時(shí)間為12.30min、22.90min，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見圖1、圖2。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

以1.5.1中所述方法對混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行液相色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，作校正曲線并進(jìn)行線性回歸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：棉子糖和水蘇糖分別在1～10mg/mL、1～10mg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9925、0.9971，以3倍信號比(S/N)為檢出限(LOD)，棉子糖為0.43mg/mL，水蘇糖為0.39mg/mL，回歸方程見圖3、圖4。

2.5 精密度測定

取同一大豆低聚糖粉樣品，按照1.4進(jìn)行處理，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果棉子糖和水蘇糖的RSD分別為2.50%和0.16%(見表1)。

表1 檢測方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

在濾液中加入一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法處理后進(jìn)行HPLC分析，棉子糖和水蘇糖的平均回收率為95.8%和96.0%，RSD為1.57%和1.81%，結(jié)果見表2。

2.7 樣品測定

任意選取三份大豆低聚糖粉樣品，按上述方法處理后進(jìn)行測定分析，測定結(jié)果見表3。

表2 添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表3 大豆低聚糖粉樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了采用示差折光檢測器(RID)，色譜柱為Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6mm×150mm,5μm)，流動相為乙腈-水(75∶25,V∶V)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，同時(shí)測定大豆低聚糖粉中棉子糖和水蘇糖含量的高效液相色譜分析方法（HPLC）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：棉子糖和水蘇糖分別在1～10mg/mL、1～10mg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9925、0.9971；2種糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.57%、1.81%(n=5)，平均回收率分別為95.8%、96.0%。該方法適用于大豆低聚糖粉中棉子糖和水蘇糖含量的檢測。

［1］李本楠，甘卉．大豆低聚糖理化性質(zhì)及其生理功能[J]．中國實(shí)用醫(yī)藥，2009，(9)：238-239．

［2］唐春江,鄧放明,王喬隆，等．大豆低聚糖的研究進(jìn)展[N].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2008，(2):33-37.

［3］董愛軍，張英春，楊鑫，等．高效液相色譜法測定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉子糖[J]．食品工業(yè)科技，2008，(12)：245-247．

［4］GB/T 22491-2008大豆低聚糖[S]．

［5］馬鶯,駱承祥,吳昊.高效液相色譜法測定大豆乳清中大豆低聚糖[J].分析化學(xué),1999,27(3):367.

［6］張延伸，張東祥，劉國忠，等．高效液相色譜法測定大豆低聚糖[J]．食品工業(yè)，2000，(2)：45-46．

［7］朱建華，楊曉泉．反相液相色譜法同時(shí)測定大豆制品中的功能性低聚糖—水蘇糖和棉子糖[J]．糧油加工與食品機(jī)械，2005，(11)：75-76．