張強,宮璐嬋,孟凡榮,孫鳳揚,高加樂

(安徽科技學院生命科學學院,安徽 鳳陽 233100)

雙孢菇(Agaricus bisporus)又叫白蘑菇、洋蘑菇、草腐菌,是中低溫性菇類。它含有高蛋白,并且富含氨基酸和多種維生素,具有降血脂、抗病毒、抗腫瘤、增強機體免疫力等保健功能。我國雙孢菇的產量和出口量均居世界第一,但是其深加工水平還很落后,高附加值的產品幾乎沒有。另外,由于雙孢菇含水量高,采摘后的保存時間較短,因此對其進行深加工勢在必行[1]。

多糖是一類廣泛存在于動植物、微生物細胞中的重要生物大分子物質,具有廣泛的藥理作用,如作為免疫調節(jié)劑、促進細胞因子生成、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、防衰老、降血糖、降血脂等。近些年來,對食用菌多糖研究較多,但大多局限于提取工藝方面[2-5],對其生物學功能特別是抗氧化功能研究較少,對雙孢菇多糖的抗氧化活性研究目前尚未見報道。本文旨在通過幾個體外實驗體系研究雙孢菇多糖的抗氧化活性,以期提高雙孢菇產品的附加值,為使雙孢菇多糖作為天然抗氧化劑和功能性食品得到開發(fā)利用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料 雙孢菇,鳳陽縣小崗村雙孢菇生產基地。

1.1.2 主要試劑 無水乙醇、甲醇、濃硫酸,上海中試化工總公司;蒽酮、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、EDTA,中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司;磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、氯化亞鐵,上?；瘜W試劑有限公司;磷酸氫二鈉,上海展云化工有限公司;過氧化氫,上海桃浦化工廠;2,6-二叔丁基-4-甲基酚(BHT),河南華美食品添加劑有限公司;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH):sigma公司;菲咯嗪(Ferrozine):fluka公司。

1.2 主要儀器

7230 G可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);數顯恒溫水浴鍋 HH-4,國華電器有限公司;TDL-5A離心機,上海安亭科學有限公司;756 MC紫外分光光度計,中國上海分析儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙孢菇多糖的提取工藝[6]

新鮮雙胞菇子實體→自然光下風干→粉碎→熱水浸提(液料比 40 mL/g,72℃,3 h)→離心 10 min(4800r/min)→上清液→濃縮→醇析(4倍體積無水乙醇)→沉淀→干燥→粗多糖制品。

1.3.2 雙孢菇多糖含量測定

采用蒽酮-硫酸法[7]測定多糖含量。

1.3.3 雙孢菇多糖抗氧化活性的測定

1.3.3.1 還原力的測定[8]。向試管中加入一定體積濃度為1 mg/mL的樣品,用磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH 6.6)補足至2.5 mL。再加入5 mL質量分數1%的鐵氰化鉀,置于50℃恒溫水浴中反應20 min。再加入5 mL質量分數10%的三氯乙酸溶液,搖勻,靜置5 min。取上清液 2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和 0.5 mL質量分數1%的FeCl3溶液,搖勻,于700 nm測定其吸光度,吸光度值越大表示還原力越強。同時以等體積的 0.1mg/mL的BHT代替樣品作為陽性對照。

1.3.3.2 對Fe2+螯合能力的測定[9]。向試管中加入一定體積的濃度為 1 mg/mL的樣品,再依次加入 0.1 mL 2mmol/L的FeCl2,0.2 mL 5 mmol/L的Ferrozine,搖勻,用蒸餾水補足至5 mL,在室溫下放置20 min,于波長562 nm下測定吸光度,根據吸光度計算螯合率,同時用等體積的 0.1 mg/mL的EDTA代替樣品作為陽性對照。

1.3.3.3 對DPPH自由基清除能力的測定[10]。在試管中依次加入2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液,一定體積的濃度為1 mg/mL的樣品,最后用體積分數70%的乙醇補足到4 mL,搖勻,避光20 min后于517 nm處測定吸光度,根據吸光度值計算清除率,同時以等體積的0.1mg/mL的BHT代替樣品作為陽性對照。

1.3.3.4 清除羥基自由基能力的測定[11]。在試管中依次加入一定體積的濃度為 1 mg/mL樣品,1mL 9mmol/L的FeSO4-EDTA溶液,1mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液 (空白不加),最后各管再加1mL 8.8 mmol/L H2O2,各管用蒸餾水足至 5 mL,搖勻,于510nm處測吸光度,根據吸光度值計算清除率,同時以體積、等濃度的抗壞血酸代替樣品作為陽性對照。

1.3.3.5 清除超氧陰離子自由基能力的測定[12]。向試管中加入一定體積的濃度為 2 mg/mL的樣品,再加入6.0 mL 50mmol/L pH8.2的Tris-Hcl緩沖液,最后用蒸餾水補足至9 mL,搖勻,于37℃水浴10 min。取出后加入37℃預熱過的3.5 mmol/L鄰苯三酚溶液1.0 mL,精確反應6 min,立即用0.5 mL 8.0 mol/L的濃鹽酸終止反應,于320 nm波長處測定吸光度,根據吸光度值計算清除率,同時以0.2mg/mL的抗壞血酸代替樣品作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 雙孢菇多糖的還原力

圖1 雙孢菇多糖的還原力

物質的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關性,還原能力的高低可以間接反映抗氧化能力的強弱。由圖1可以看出:雙孢菇多糖具有較強的還原力,且呈一定的量效關系,但本實驗條件下雙孢菇多糖的還原力不及BHT。

2.2 雙孢菇多糖對Fe2+的螯合能力

圖2 雙孢菇多糖對Fe2+的螯合能力

一些金屬離子包括Fe2+極易通過Fenton反應等作用催化脂質、蛋白質和其他細胞組分氧化,造成細胞或組織氧化損傷。因此,對金屬離子螯合能力大小的測定也是評價抗氧化劑抗氧化性能常用的方法。螯合能力愈大,被評價的抗氧化劑潛在的抗氧化性就愈強。由圖2可知,雙孢菇多糖具有較強的螯合能力,本實驗條件下,1 mg/mL的雙孢菇多糖的螯合能力優(yōu)于0.1 mg/mL的EDTA。

2.3 雙孢菇多糖對DPPH自由基的清除作用

圖3 雙孢菇多糖對DPPH自由基的清除作用

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,其在517 nm附近有強吸收(呈深紫色)。當自由基清除劑存在時,DPPH的孤對電子被配對,其 517 nm吸收消失或減弱,通過測定吸收減弱的程度,可評價自由基清除劑的活性,因此,DPPH分析法被廣泛用于清除自由基物質性質的研究。

從圖3可以看出,雙孢菇多糖對DPPH自由基具有很強的清除活性,1 mg/mL的雙孢菇多糖對DPPH自由基的清除活性明顯強于0.1 mg/mL的BHT。

2.4 雙孢菇多糖對羥基自由基的清除作用

圖4 雙孢菇多糖對羥基自由基的清除作用

利用 Fenton反應產生羥基自由基,水楊酸法檢測羥基自由基及物質清除羥基自由基的能力。在此法中,羥基自由基進攻水楊酸分子的苯環(huán)產生能用分光光度法測量的羥基化合物 2,3-二羥基苯甲酸,可用該產物生成的多少來描述羥基的量及待測物質清除羥基自由基的能力。從圖 4可以看出,雙孢菇多糖對Fenton反應產的羥基自由基具有明顯的清除作用,量效關系明顯,且雙孢菇多糖對羥基自由基的清除能力優(yōu)于等濃度的抗壞血酸。

2.5 雙孢菇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

圖5 雙孢菇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子自由基是形成最早的、最重要的、與人類關系最密切的自由基之一,可通過減低或抑制酶的活性而影響代謝,造成氧中毒。由圖 5可以看出,雙孢菇多糖對鄰苯三酚法反應產的超氧陰離子自由基具有明顯的清除作用,且呈現(xiàn)良好的量效關系,2 mg/mL的雙孢菇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用優(yōu)于0.2 mg/mL的抗壞血酸。

3 討論

本研究的某些實驗模型中雙孢菇多糖表現(xiàn)出的抗氧化活性并不及其陽性對照物BHT、EDTA、抗壞血酸等,但是雙孢菇多糖是一種天然抗氧化劑,成本低廉,安全無毒。而且目前已有資料表明,對已有的抗氧化多糖進行硫酸化、硒化等結構修飾后,所得的硫酸化多糖和硒化多糖比修飾前的抗氧化活性有較大改善[14-15]。因此,如果能對雙孢菇多糖作進一步的改造,可望得到一種安全高效、經濟實用的天然抗氧化劑,并在食品、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品等行業(yè)應用,這無疑將拓寬雙孢菇產品的應用范圍,大大提高其附加值。

4 結論

雙孢菇多糖具有較強的還原力和螯合能力,對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有不同程度的清除活性,表明雙孢菇多糖具有良好的體外抗氧化活性,作為天然抗氧化劑具有很好的開發(fā)潛力,在食品、醫(yī)藥領域有廣泛的應用前景。本文尚未分析雙孢菇多糖的組成、結構、分子量、構效關系,有待后續(xù)實驗進一步研究。

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