繆成貴,韓飛園,鐘敏

(安徽科技學院,安徽 鳳陽 233100)

食品中常用的抗氧化劑丁基羥基茴香醚,二丁基羥基甲苯,叔丁基對苯二酚,沒食子酸丙酯等,由于毒性和致癌作用等原因,許多國家已停止或嚴格限制其使用。尋找和開發(fā)天然、無毒的天然抗氧化劑已成為人們關(guān)心的焦點。黃酮類化合物[1-4]廣泛存在于植物體內(nèi),無不良反應(yīng),同時還有顯著的清除人體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂、降血壓等藥理保健功能[5],是一類極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑[6]。香菇在我國種植廣泛,資源極其豐富,是人們十分喜愛的一種食用真菌。目前食用真菌的活性成分研究主要集中在多糖類成分,黃酮類成分的研究較少,本文以香菇總黃酮為研究對象,考察了香菇總黃酮的提取工藝和抗油脂氧化作用。為香菇的采后深加工和從食用真菌中制備黃酮類天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香菇,安徽科技學院食用菌研究所提供;蘆丁標準樣品,上海嘉韋化學試劑有限公司;756MC紫外光分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 正交試驗設(shè)計。以香菇總黃酮含量為考察指標,選擇乙醇濃度、加醇量、提取時間作為考察的三個影響,按3因素3水平進行L9(34)正交試驗設(shè)計[7-8],香菇因素水平見表1。

1.2.2 樣品溶液的制備。稱取香菇15.3g,置500mL圓底燒瓶配套的索氏提取器中,圓底燒瓶上接索氏提取器,用石油醚脫脂1.5h,按因素水平表分別用不同濃度的乙醇回流提取,回收乙醇,用蒸餾水定容至500 mL[9-11]。

1.2.3 對照品溶液的制備[12]。精密稱取120℃度干燥至恒重的蘆丁200mg置100mL容量瓶中,加甲醇適量,超聲波水浴上微熱并振蕩約1h使其溶解,冷卻,加甲醇至刻度,搖勻,精密量取上述試液 10.0mL,置100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻即得蘆丁標準液(每1mL含無水蘆丁0.2mg)。

表1 香菇正交試驗因素水平表

1.2.4 油脂抗氧化作用的測定。采用烘箱儲藏法測定[13]。將純豬油及添加一定量的香菇提取物溶液的豬油置于65℃烘箱,按照國家標準GB/55438-85,每隔一定時間測定并計算其過氧化值(POV)。即精密稱取2～3 g混勻的樣品,置于250mL碘量瓶中,加入氯仿-冰醋酸(2∶3)混合液30mL,使樣品完全溶解加飽和碘化鉀溶液1mL,加塞、搖勻,在暗處放置3min,加水50mL,搖勻后立即用0.02mol/L硫代硫酸鈉標準溶液滴定至淡黃色時,加0.5%淀粉指示劑1mL,繼續(xù)滴定至藍色消失為止。同時以空白試劑滴定為參比。

其中,V1和V2分別為樣品和空白試劑消耗Na2S2O3標準溶液的體積(mL);C為硫代硫酸鈉溶液的濃度(mol/L),W為樣品質(zhì)量(g);0.1269為1mg硫代硫酸鈉相當?shù)獾馁|(zhì)量數(shù)(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的確定

精密量取蘆丁標準液4mL置25mL容量瓶。加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL使混勻。放置6min。加10%硝酸鋁溶液1.0mL,搖勻,放置6min。加1%氫氧化鈉溶液10.0mL,再加水至刻度,搖勻。放15min。置比色皿中。在波長400～700nm范圍內(nèi)進行掃描,從而選擇最大吸收處為測定波長。通過掃描圖可以確定:蘆丁標準液在約510nm波長處吸收最大。因此實驗中黃酮類物質(zhì)分析吸收波長確定為510nm。

2.2 標準曲線的繪制

精密量取標準品溶液 1 、2、3、4 、5、6mL,分別置于25mL容量瓶,各加蒸餾水至6mL,加5%NaNO2溶液1mL,搖勻。放置 6min,加 10%Al(NO3)3溶液 1mL,搖勻,放置6 min,加4%NaOH 溶液10mL。再加水至刻度,搖勻,放置15 min,以相應(yīng)試劑為空白對照,照紫外分光光度法,在510nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得方程:y=8.8214x,R2=0.9998。

圖1 蘆丁標準液吸收波長掃描圖

2.3 精密度試驗

精密吸取蘆丁對照品溶液3.0mL于25mL量瓶中,共3份,按上述方法顯色后于510 nm處測定吸收度。每份測定4次,記錄吸光度值。這些吸光度值的RSD為1.764%。表明本方法有較高的精密度。

2.4 回收率試驗

精密稱定香菇總黃酮提取液樣品約30mL左右,共3份,加入一定量的蘆丁對照品,計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 香菇的回收率試驗

2.5 黃酮的測定

用吸量管精密吸取3mL提取液,置于25mL容量瓶中,加蒸餾水至6.0mL,加5%NaNO2溶液1mL搖勻,放置6 min,加 10%Al(NO3)3溶液 1mL,搖勻,放置6 min,加4%NaOH 溶液10mL,再加水至刻度,搖勻,放置15min,以相應(yīng)試劑為空白,在756MC紫外分光光度計510nm波長處測定吸光度。

2.6 正交試驗結(jié)果

香菇總黃酮提取正交試驗中各因素和水平之間的9種組合方式及每組結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果見表4。由表3、4結(jié)果可知,在乙醇提取香菇總黃酮的影響因素中,乙醇濃度的影響最顯著,加醇量和提取時間影響較小,理論條件為A1B1C1,但考慮到提取時間和乙醇量的極差很小,更為經(jīng)濟的條件為A1B3C3,即15.3g的香菇提取黃酮的最合理條件為200mL 95%的乙醇提取1h。

2.7 香菇總黃酮對豬油的抗氧化活性

將純豬油及添加0.20%、0.40%、0.60%香菇總黃酮提取液的豬油樣品置于65℃恒溫烘箱中,間隔3天測定,計算其POV值,結(jié)果見表5。可見,香菇總黃酮對豬油的氧化具有明顯的抑制作用,且隨著質(zhì)量分數(shù)的增大其抗氧化能力增強。

表3 香菇正交試驗結(jié)果

表4 香菇方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實驗以香菇總黃酮含量為考察指標,選擇乙醇濃度、加醇量、提取時間作為考察的3個影響,按3因素3水平進行L9(34)正交試驗設(shè)計,并設(shè)計了誤差列,考察乙醇濃度、加醇量、提取時間3個因素對其總黃酮提取的影響。理論條件為A1B1C1,但考慮到提取時間和乙醇量的極差很小,更為經(jīng)濟的條件為A1B3C3,即15g的香菇提取黃酮的最合理條件為200mL95%的乙醇提取1h。方差分析中[14],加醇量、提取時間的偏差平方和與誤差列的偏差平方和相差不大或其值很小而無太大的統(tǒng)計學意義,因此在F檢驗時將加醇量、提取時間的偏差平方和誤差列的偏差平方和累加,其自由度也相應(yīng)的累加計算F值。采用烘箱儲藏法測定香菇總黃酮抗油脂氧化作用,結(jié)果表明,香菇總黃酮對豬油的氧化具有明顯的抑制作用,且隨著質(zhì)量分數(shù)的增大其抗氧化能力增強。

表5 香菇總黃酮對豬油的抗氧化作用

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