繆成貴,韓飛園,鐘敏

(安徽科技學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

食品中常用的抗氧化劑丁基羥基茴香醚,二丁基羥基甲苯,叔丁基對(duì)苯二酚,沒(méi)食子酸丙酯等,由于毒性和致癌作用等原因,許多國(guó)家已停止或嚴(yán)格限制其使用。尋找和開(kāi)發(fā)天然、無(wú)毒的天然抗氧化劑已成為人們關(guān)心的焦點(diǎn)。黃酮類(lèi)化合物[1-4]廣泛存在于植物體內(nèi),無(wú)不良反應(yīng),同時(shí)還有顯著的清除人體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂、降血壓等藥理保健功能[5],是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑[6]。香菇在我國(guó)種植廣泛,資源極其豐富,是人們十分喜愛(ài)的一種食用真菌。目前食用真菌的活性成分研究主要集中在多糖類(lèi)成分,黃酮類(lèi)成分的研究較少,本文以香菇總黃酮為研究對(duì)象,考察了香菇總黃酮的提取工藝和抗油脂氧化作用。為香菇的采后深加工和從食用真菌中制備黃酮類(lèi)天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

香菇,安徽科技學(xué)院食用菌研究所提供;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品,上海嘉韋化學(xué)試劑有限公司;756MC紫外光分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以香菇總黃酮含量為考察指標(biāo),選擇乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間作為考察的三個(gè)影響,按3因素3水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7-8],香菇因素水平見(jiàn)表1。

1.2.2 樣品溶液的制備。稱取香菇15.3g,置500mL圓底燒瓶配套的索氏提取器中,圓底燒瓶上接索氏提取器,用石油醚脫脂1.5h,按因素水平表分別用不同濃度的乙醇回流提取,回收乙醇,用蒸餾水定容至500 mL[9-11]。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備[12]。精密稱取120℃度干燥至恒重的蘆丁200mg置100mL容量瓶中,加甲醇適量,超聲波水浴上微熱并振蕩約1h使其溶解,冷卻,加甲醇至刻度,搖勻,精密量取上述試液 10.0mL,置100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(每1mL含無(wú)水蘆丁0.2mg)。

表1 香菇正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 油脂抗氧化作用的測(cè)定。采用烘箱儲(chǔ)藏法測(cè)定[13]。將純豬油及添加一定量的香菇提取物溶液的豬油置于65℃烘箱,按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/55438-85,每隔一定時(shí)間測(cè)定并計(jì)算其過(guò)氧化值(POV)。即精密稱取2～3 g混勻的樣品,置于250mL碘量瓶中,加入氯仿-冰醋酸(2∶3)混合液30mL,使樣品完全溶解加飽和碘化鉀溶液1mL,加塞、搖勻,在暗處放置3min,加水50mL,搖勻后立即用0.02mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色時(shí),加0.5%淀粉指示劑1mL,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止。同時(shí)以空白試劑滴定為參比。

其中,V1和V2分別為樣品和空白試劑消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);C為硫代硫酸鈉溶液的濃度(mol/L),W為樣品質(zhì)量(g);0.1269為1mg硫代硫酸鈉相當(dāng)?shù)獾馁|(zhì)量數(shù)(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液4mL置25mL容量瓶。加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL使混勻。放置6min。加10%硝酸鋁溶液1.0mL,搖勻,放置6min。加1%氫氧化鈉溶液10.0mL,再加水至刻度,搖勻。放15min。置比色皿中。在波長(zhǎng)400～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,從而選擇最大吸收處為測(cè)定波長(zhǎng)。通過(guò)掃描圖可以確定:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在約510nm波長(zhǎng)處吸收最大。因此實(shí)驗(yàn)中黃酮類(lèi)物質(zhì)分析吸收波長(zhǎng)確定為510nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1 、2、3、4 、5、6mL,分別置于25mL容量瓶,各加蒸餾水至6mL,加5%NaNO2溶液1mL,搖勻。放置 6min,加 10%Al(NO3)3溶液 1mL,搖勻,放置6 min,加4%NaOH 溶液10mL。再加水至刻度,搖勻,放置15 min,以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,照紫外分光光度法,在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得方程:y=8.8214x,R2=0.9998。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸收波長(zhǎng)掃描圖

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液3.0mL于25mL量瓶中,共3份,按上述方法顯色后于510 nm處測(cè)定吸收度。每份測(cè)定4次,記錄吸光度值。這些吸光度值的RSD為1.764%。表明本方法有較高的精密度。

2.4 回收率試驗(yàn)

精密稱定香菇總黃酮提取液樣品約30mL左右,共3份,加入一定量的蘆丁對(duì)照品,計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 香菇的回收率試驗(yàn)

2.5 黃酮的測(cè)定

用吸量管精密吸取3mL提取液,置于25mL容量瓶中,加蒸餾水至6.0mL,加5%NaNO2溶液1mL搖勻,放置6 min,加 10%Al(NO3)3溶液 1mL,搖勻,放置6 min,加4%NaOH 溶液10mL,再加水至刻度,搖勻,放置15min,以相應(yīng)試劑為空白,在756MC紫外分光光度計(jì)510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

香菇總黃酮提取正交試驗(yàn)中各因素和水平之間的9種組合方式及每組結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表3、4結(jié)果可知,在乙醇提取香菇總黃酮的影響因素中,乙醇濃度的影響最顯著,加醇量和提取時(shí)間影響較小,理論條件為A1B1C1,但考慮到提取時(shí)間和乙醇量的極差很小,更為經(jīng)濟(jì)的條件為A1B3C3,即15.3g的香菇提取黃酮的最合理?xiàng)l件為200mL 95%的乙醇提取1h。

2.7 香菇總黃酮對(duì)豬油的抗氧化活性

將純豬油及添加0.20%、0.40%、0.60%香菇總黃酮提取液的豬油樣品置于65℃恒溫烘箱中,間隔3天測(cè)定,計(jì)算其POV值,結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn),香菇總黃酮對(duì)豬油的氧化具有明顯的抑制作用,且隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大其抗氧化能力增強(qiáng)。

表3 香菇正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 香菇方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以香菇總黃酮含量為考察指標(biāo),選擇乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間作為考察的3個(gè)影響,按3因素3水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),并設(shè)計(jì)了誤差列,考察乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)其總黃酮提取的影響。理論條件為A1B1C1,但考慮到提取時(shí)間和乙醇量的極差很小,更為經(jīng)濟(jì)的條件為A1B3C3,即15g的香菇提取黃酮的最合理?xiàng)l件為200mL95%的乙醇提取1h。方差分析中[14],加醇量、提取時(shí)間的偏差平方和與誤差列的偏差平方和相差不大或其值很小而無(wú)太大的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此在F檢驗(yàn)時(shí)將加醇量、提取時(shí)間的偏差平方和誤差列的偏差平方和累加,其自由度也相應(yīng)的累加計(jì)算F值。采用烘箱儲(chǔ)藏法測(cè)定香菇總黃酮抗油脂氧化作用,結(jié)果表明,香菇總黃酮對(duì)豬油的氧化具有明顯的抑制作用,且隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大其抗氧化能力增強(qiáng)。

表5 香菇總黃酮對(duì)豬油的抗氧化作用

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