李福如，繆 婧，顧海琳，洪雪勤

（1.江蘇省南通市中醫(yī)院，江蘇 南通 226001； 2.南通大學(xué)，江蘇 南通 226001）

清腦寧顆粒是我院腦外科的科研制劑，由赤芍、當(dāng)歸、川芎、陳皮等10味中藥組成，具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛、安神的功效，對腦外傷后的頭痛、失眠及腦功能恢復(fù)有較好療效。根據(jù)處方藥物的理化性質(zhì)，筆者采用薄層色譜（TLC）法對方中主藥（赤芍、當(dāng)歸、川芎、陳皮）進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對赤芍中芍藥苷進(jìn)行含量測定，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD型高效液相色譜儀。層析用硅膠（青島海洋化工廠）；芍藥苷對照品（批號為110736-200731）、阿魏酸對照品（批號為110773-200611）、橙皮苷對照品（批號為110721-200613），均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

赤芍[1]109：取清腦寧顆粒1 g，加乙醇20 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；按處方制備不含赤芍的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液；取赤芍對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品藥材溶液及對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)（圖1 A）。

當(dāng)歸[1]89：取清腦寧顆粒4 g，加1%碳酸氫鈉溶液50 mL，用力攪拌，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，用乙醚10 mL振搖提取，取上層乙醚液，置水浴揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；按處方制備不含當(dāng)歸的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液；取當(dāng)歸對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；另取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯 -甲酸（4∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新配制的1%三氯化鐵和1%鐵氰化鉀（1∶1）的混合溶液，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)（圖1 B）。

川芎[1]28：取當(dāng)歸鑒別項(xiàng)下供試品溶液，作為供試品溶液；按處方制備不含川芎的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液；取川芎對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；另取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸（4∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新配制的1%三氯化鐵和1%鐵氰化鉀（1∶1）的混合溶液，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)（圖1 C）。

陳皮[1]132：取清腦寧顆粒 0.5 g，加甲醇 10 mL，振搖 5 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；按處方制備不含陳皮的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液；取陳皮對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。吸取上述供試品溶液及陰性對照品溶液2～5 μL，對照藥材溶液及對照品溶液2 mL，分別點(diǎn)于用0.5%氫氧化鈉溶液制成的同一硅膠G薄層板上，先以醋酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13），再以甲苯 -醋酸乙酯 -甲酸 -水（20∶10∶1∶1）的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試劑，熱風(fēng)吹干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的熒光斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)（圖1 D）。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定[1]109，[2-3]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：島津 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（30∶70）；檢測波長：230 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL。理論塔板數(shù)按芍藥苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000，方中其他成分對芍藥苷的含量測定無影響（圖2）。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

精密稱取芍藥苷對照品12 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為120 μg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 mL含芍藥苷60 μg）。取裝量差異項(xiàng)下樣品內(nèi)容物研細(xì)，取8 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理50 min，放置室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，棄去初濾液，即得供試品貯備液。精密量取供試品貯備液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按處方制備不含赤芍的顆粒，精密稱取該空白樣品8 g，同法操作制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別吸取對照品貯備液 1，2，3，5，8 mL，置 10 mL量瓶中，制得質(zhì)量濃度為 12，24，36，60，96，120 μg/mL 的對照品溶液，分別進(jìn)樣2次，每次50 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積平均值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=13 924X-195.23，r2=0.999 8（n=6）。結(jié)果表明，芍藥苷質(zhì)量濃度在 12～120 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的RSD 為 0.67% （n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于室溫放置 0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的 RSD=0.65%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取樣品8.0 g，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果含量的 RSD=1.60%（n=5）。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（批號為20080308，含量為7.4 mg/袋，平均裝量為10.152 1 g），精密加入0.1 mg的芍藥苷對照品，按供試品溶液制備方法制備溶液并進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果批號為080313，080320，080327的每袋樣品中芍藥苷含量分別為7.11，7.24，7.05 mg，RSD=1.36%。

3 討論

在TLC色譜中，供試品、對照藥材溶液及對照品溶液在相應(yīng)的位置呈相同顏色斑點(diǎn)，說明本定性鑒別方法是合理可行的。

參照2005年版《中國藥典（一部）》赤芍項(xiàng)下含量測定方法中流動相的比例，分析時(shí)間較短，但分離度達(dá)不到要求，經(jīng)調(diào)整流動相比例，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（30∶70）為流動相時(shí)效果較好。該方法準(zhǔn)確度高，加樣回收率、重現(xiàn)性好，可作為清腦寧顆粒的質(zhì)量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2]張 玲.高效液相色譜法測定參梅養(yǎng)胃顆粒中芍藥苷的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（1）:77-78.

[3]李道明，周修森.SPE-HPLC法測定補(bǔ)中益腎丸中芍藥苷的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（1）:71-73.