李偉奇,劉湘新,李俊超,賀建華*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,湖南長沙 410128;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128)

10種中藥提取物對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌抑菌作用的研究*

李偉奇1,2,劉湘新3,李俊超3,賀建華1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,湖南長沙 410128;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128)

為了解研究中藥提取物對(duì)耐藥菌的抑菌作用,采用紙片法和倍比稀釋法研究10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用;用點(diǎn)種法和藥敏紙片法研究耐藥抑轉(zhuǎn)作用。結(jié)果顯示,10種中藥水提物中黃芩水提取物對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌抑制效果最明顯。耐藥性抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,只有黃芩水提取物對(duì)Sa1的耐藥性有明顯的抑制作用,抑制率達(dá)65%,但對(duì)其他菌株的抑制作用則表現(xiàn)不明顯;藥敏紙片法顯示黃芩對(duì)細(xì)菌耐藥性有最強(qiáng)抑制作用。表明中藥水提取物對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌有抑制作用,且部分藥物抑菌作用明顯;黃芩水提取物對(duì)Sa1菌株具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

水提取物;耐藥金色葡萄球菌;體外抑菌試驗(yàn);中藥

*通訊作者

隨著抗菌藥物在臨床醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥問題日趨嚴(yán)重,其耐藥水平越來越高,出現(xiàn)了多重耐藥菌株,給人類和動(dòng)植物的健康帶來極大的危害,細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)成為全球關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)[1-2]。由于耐藥性是細(xì)菌在不良生存環(huán)境下產(chǎn)生的本能生理反應(yīng),是適應(yīng)環(huán)境維持生命所必需的特性,因而不管研制什么樣的新一代藥物都不可能完全避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[3]。為此,研究耐藥性抑制劑,關(guān)系到人類和動(dòng)植物的健康。近年來,世界各國除繼續(xù)致力于篩選對(duì)耐藥菌有效且具有新抗菌譜、新作用機(jī)制的抗生素之外,還開始尋找能夠提高抗生素效能、頡頏細(xì)菌耐藥性的物質(zhì)。已有研究顯示,一些化學(xué)試劑雖有逆轉(zhuǎn)多重耐藥的功效,但因其具有較大的毒副作用,使臨床應(yīng)用受到限制[3]。從20世紀(jì)90年代至今,相關(guān)研究報(bào)道表明[2],某些中藥具有逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用,因此,從我國天然、低毒的中藥中篩選耐藥抑制劑,成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上,探討了10種中藥對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的體外抑制作用和耐藥逆轉(zhuǎn)作用,以期為中藥耐藥抑制劑的研究開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌(Sa1 、Sa2 、Sa3、Sa4 、Sa5)均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供,其 MIC值見表 1;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC25923(Sa)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 金黃色葡萄球菌耐藥譜Table 1 The spectrum of Staphylococcus aureus resistant to fluoroquinolones μg/mL

1.1.2 藥品 黃芩、艾葉、細(xì)辛等中藥購自長沙養(yǎng)天和大藥房;環(huán)丙沙星原料藥購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物藥廠。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 耐藥金黃色葡萄球菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板37℃培養(yǎng)18 h～24 h,挑選典型菌落接種于肉湯中,再經(jīng)37℃肉湯培養(yǎng)18 h后,將菌液稀釋至105～106個(gè)菌/mL備用[4-5]。

1.2.2 中藥水提物的制備 10種中藥水提取液的制備[8-9]:藥物與水以1∶10比例浸泡24 h,80℃中回流提取2 h,過濾;濾渣再加5倍量體積水回流提取2 h,過濾;合并濾液,濃縮至含生藥1 g/mL[6-7]。1.2.3 藥敏紙片法 取含生藥1 g/mL的中藥水提液溶液1.5 mL,放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片(10片為1組)50片,浸泡2 h。待其自然干燥后,用紫外線照射滅菌10 min～15 min。取滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基15 mL,倒入已滅菌的平皿內(nèi),使其厚度為4 mm,待冷卻凝固后,每個(gè)平皿劃分為4區(qū),用移液槍吸取0.1 mL菌液于平皿內(nèi),用玻棒鋪勻,然后貼上含有藥液的紙片,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)直尺測(cè)定抑菌圈直徑,取平均值,判定按NCCLS 2008年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[10]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 參照NCCLS推薦的微量稀釋法(microdilution method)進(jìn)行。相同過程重復(fù)3次。

試管法[11]:中藥提取液由于顏色太深,難于直觀判定。因此用葡萄糖酚紅液體培養(yǎng)基代替普通培養(yǎng)基。取60支滅菌帶棉塞的試管,每12支為一組,編號(hào)。在超凈臺(tái)上每支試管內(nèi)分別加入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基1.0 mL。將配制藥液作二倍遞減濃度稀釋(即1～10號(hào)試管內(nèi)藥物濃度依次為0.5、0.25、0.125 、0.062 5 、0.030 8 、0.016 、0.008 、0.004 、0.002和0.001 g/mL)。然后在1號(hào)～10號(hào)試管每管分別加入菌液 0.1 mL,第11號(hào)試管只加肉湯和藥液1 mL,不加菌液,作為對(duì)照,觀察藥物是否污染,第12號(hào)試管加葡萄糖酚紅液體培養(yǎng)基1.0 mL,菌液0.1 mL,作為細(xì)菌對(duì)照,觀察細(xì)菌是否正常生長。然后將試驗(yàn)管和對(duì)照管置 37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出,觀察并判定藥物對(duì)此菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 金色葡萄球菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,有細(xì)菌生長的酚紅指示劑變?yōu)辄S色,藥液透明管直接判讀[12-13]。凡是色澤深暗管,在培養(yǎng)24 h后用移液器分別吸取0.1 mL培養(yǎng)物,移種于不含藥的普通營養(yǎng)瓊脂上,輕輕推開藥液,置37℃培養(yǎng)過夜。觀察有無細(xì)菌生長,按一般規(guī)定,平皿培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù)應(yīng)少于5個(gè)菌落者作為該藥物的最低殺菌濃度(MBC);反之,無細(xì)菌生長各試驗(yàn)管培養(yǎng)物,經(jīng)移種于平皿培養(yǎng)基后,各濃度均有細(xì)菌生長,該藥物為抑菌作用無效。

1.2.6 耐藥性抑制試驗(yàn)測(cè)定 采用平板點(diǎn)種法[3]。將試驗(yàn)用耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌(Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5)分別在不含藥物和含亞抑菌濃度的中藥水提取液的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,取出少量菌液經(jīng)稀釋后(OD在0.3～0.5之間)涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng),16 h后獲得大量單個(gè)菌落,選取200個(gè)單個(gè)菌落,然后一一對(duì)應(yīng),將單個(gè)菌落點(diǎn)種于含亞抑菌濃度環(huán)丙沙星的瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)18 h～20 h,觀察并依據(jù)公式計(jì)算耐藥菌抑制率。抑制率=(點(diǎn)種菌落數(shù)-藥物平板生長菌落數(shù))/點(diǎn)種菌落數(shù)。

藥敏紙片法[14]。試驗(yàn)用金黃色葡萄球菌在含亞抑菌濃度中藥LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,取出少量稀釋(約1 000倍,以獲得薄層菌苔為宜)后每個(gè)平板培養(yǎng)基涂布0.1 mL,待培養(yǎng)基表面干燥后將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面,37℃培養(yǎng)18 h觀察。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果

2.1.1 抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌不同菌株的抑菌圈直徑見表2,結(jié)果表明,黃芩對(duì)5種耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌不同菌株體外抑制作用最強(qiáng),其次是艾葉、馬兜鈴等,半夏作用最弱。

2.1.2 MIC測(cè)定結(jié)果 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果見表3,結(jié)果表明,黃芩對(duì)5種耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的MIC最低,說明其抑菌作用最強(qiáng),其次是艾葉、羅漢果等,半夏最大。同時(shí),同一藥物對(duì)不同菌株的MIC不同。

表2 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌5種株型的抑菌圈直徑Table 2 The Bacteriostasis circle diameters of water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to resistant fluoroquinolones S.aureus mm

表3 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌5種株型的MIC值Table 3 The MIC Values of the water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to S.aureus which resistant to fluoroquinolones g/mL

2.1.3 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的MBC測(cè)定結(jié)果 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的MBC測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果表明,黃芩對(duì)5種耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的MBC最低,其次是艾葉、羅漢果等,半夏最大。同時(shí),同一藥物對(duì)不同菌株的MBC也不同。

表4 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的MBC值Table 4 The MBC Values of the water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to S.aureus which resistant to fluoroquinolones g/mL

2.2 耐藥性抑制試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.1 平板點(diǎn)種試驗(yàn)結(jié)果 10種中藥水提物的平板點(diǎn)種試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 10種中藥水提取液對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌抑制結(jié)果Table 5 The bacteriostasis effects of water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine on fluoroquinolone-resistant S.aureus

2.2.2 藥敏紙片法試驗(yàn)結(jié)果 10種中藥水提物的藥敏紙片法試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 10種中藥水提物的藥敏紙片法試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The drug sensitive test of water ex tracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to fluoroquinolones-resistant S.aureus mm

3 討論

3.1 10種中藥水提取物對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌的作用

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,10種中藥水提取物對(duì)耐氟喹諾酮類藥物金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,其中以黃芩水提取物抑菌效果最為明顯(其中3個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組的P＞0.05,說明試驗(yàn)組和對(duì)照組差異不顯著,試驗(yàn)結(jié)果基本相同),對(duì)Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5的抑菌圈分別可達(dá)到 19.6 mm±0.4 mm、20.7 mm±1.7 mm 、18.6 mm ±0.9 mm、20.5 mm±1.2 mm和18.6 mm±1.6 mm;對(duì) Sa2、Sa5的 MIC值僅為 0.008 g/mL,對(duì)其他菌株為0.016 g/mL;其余中藥水提取物按抑菌作用強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為艾葉、羅漢果、馬兜鈴、細(xì)辛、紫蘇子、矮地茶、枇杷葉、銀杏、半夏。此外,有一部分中藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌的抑菌作用強(qiáng)度基本相同(各試驗(yàn)組與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照組之間的P＞0.05為差異不顯著,P＜0.05為差異顯著),表現(xiàn)為對(duì)西藥耐藥的細(xì)菌在中藥的作用下并不耐藥,由此說明中藥對(duì)細(xì)菌的抑制作用與化學(xué)藥物有很大的區(qū)別,對(duì)化學(xué)藥物耐藥的細(xì)菌對(duì)中藥不一定耐藥。

3.2 中藥MIC測(cè)定方法探討

本試驗(yàn)中采用葡萄糖酚紅LB液體培養(yǎng)基代替普通的液體培養(yǎng)基,利用了細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,使酚紅指示劑變?yōu)辄S色的特性,解決了中藥MIC不易測(cè)定的難題,使試驗(yàn)結(jié)果便于直觀的判定。判定結(jié)果時(shí),若藥液透明可以直接讀取,若混濁,吸取0.1 mL涂布瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果,以無菌生長的最低稀釋度為該中藥粗提物的MIC。

3.3 耐藥性抑制試驗(yàn)

平板點(diǎn)種法結(jié)果表明,10種中藥水提取物中僅有黃芩水提物對(duì)Sa1的耐藥性有明顯的抑制作用,但對(duì)其他菌株的抑制作用則表現(xiàn)不明顯。藥敏紙片法顯示,黃芩、半夏、紫蘇子對(duì)細(xì)菌的耐藥性都有一定的抑制作用,矮地茶、枇杷葉、銀杏、艾葉只對(duì)部分細(xì)菌耐藥性有抑制作用,其他的中藥則沒有作用(各試驗(yàn)組與對(duì)照組之間P＜0.05),所得結(jié)果與平板點(diǎn)鐘法的結(jié)果有很大不同,此結(jié)果可能是由于中藥通過不同的途徑抑制細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的綜合效果。同時(shí)單方中藥在一定程度上能降低細(xì)菌的耐藥性,效果卻并不是太明顯。但這僅是體外抑菌試驗(yàn),中藥體外作用表現(xiàn)為單一耐藥性的丟失,體內(nèi)作用卻表現(xiàn)為多重耐藥性的丟失[15],相信在對(duì)單方中藥進(jìn)行合理配比之后定能做出更有效的復(fù)方中藥,這將在后續(xù)研究中進(jìn)一步來驗(yàn)證。本試驗(yàn)為細(xì)菌體外抑制試驗(yàn),而大多數(shù)報(bào)道體內(nèi)抑制試驗(yàn)效果好于體外抑制實(shí)驗(yàn)[15]。對(duì)于中藥抑制細(xì)菌耐藥作用的機(jī)制,中藥抑菌的機(jī)制,中藥的有效組分的研究暫時(shí)還沒有確切結(jié)論,一般認(rèn)為中藥成分復(fù)雜,各組分的效果在不同條件下所起的作用不盡相同,與西藥有特定的作用靶位不同,中藥抑制細(xì)菌是一個(gè)系統(tǒng)協(xié)同作用的結(jié)果。

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Inhibition Effects of 10 kinds of Traditional Chinese Medicine Extracts on Drug-resistantS.aureus

LI Wei-qi1,2,LIU Xiang-xin3,LI Jun-chao3,HE Jian-hua2

(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China;
2.College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China;
3.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China)

The disquisition studyies on the inhibition effect of herb extracts onS.aureusresistant to the fluoroquinolones were conducted.The inhibition effects of water soluble extract of 10 kinds of Chinese medicine onS.aureusresistant to the fluoroquinolones were investigated by paper disk method and tube dilution methodin vitro,and the MIC of scutellarias extracts on pathogenic bacteria was measured.The inhibition rate of 10 kinds Chinese medicine extracts to fluoroquinolone-resistantS.aureuswas measured by the point to point grow method and drug sensitive test.T he results showed the water soluble extracts of scutellarias had biggst inhibition effect in10 kinds of Chinese medicine,it showed significant inhibition effect to fluoroquinolone-resistant of Sa1,the inhibition rate is 65%.In the drug sensitive test,the water soluble extracts of scutellarias shows a great inhibition effect too.It indicated that water soluble extracts of 10 kinds of Chinese medicine had significantly bacteria-inhibition effect to drug-resistantS.aureus,some medicines showed evident inhibition effect.Scutellarias extract had resistant-reverse effect to Sa1 resistant ot fluoroquinolones.

water soluble extract;drug-resistantStaphylococcus aureus;inhibition effect;traditional Chinese medicine

S859.3

A

1007-5038(2010)09-0041-05

2010-02-25

國際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(2009DFA32350);國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAQ01047)

李偉奇(1985-),男,湖南長沙人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與健康研究。