馮 新,宋戰(zhàn)昀,劉 陽,張 瓊,姜永莉,丁 壯*

(1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062;2.吉林出入境檢驗檢疫局,吉林長春 130062;3.遼寧出入境檢驗檢疫局,遼寧大連 116001)

鵝源副黏病毒融合蛋白在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)*

馮 新1,宋戰(zhàn)昀2,劉 陽2,張 瓊3,姜永莉2,丁 壯1*

(1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062;2.吉林出入境檢驗檢疫局,吉林長春 130062;3.遼寧出入境檢驗檢疫局,遼寧大連 116001)

應(yīng)用特異性引物,從鵝源副黏病毒NA-1株中擴(kuò)增出F蛋白基因,PCR產(chǎn)物純化后克隆入pGEM-T載體,得到重組質(zhì)粒pT-F。用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pT-F,回收目的基因F片段,并將其定向克隆到pPICZα A中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZα A-F。用PmeⅠ酶切 pPICZα A-F使其線性化,電擊轉(zhuǎn)化至感受態(tài)畢赤酵母GS115菌中。PCR法鑒定陽性重組子,10 mL/L甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot分析。結(jié)果表明,在酵母菌培養(yǎng)基上清中檢測到相對分子質(zhì)量為63 ku的重組蛋白,該重組蛋白可與NA-1株鵝源副黏病毒多克隆抗體發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。

鵝源副黏病毒;F蛋白;畢赤酵母;表達(dá)

*通訊作者

鵝源副黏病毒編碼兩種囊膜糖蛋白,融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN),F蛋白位于囊膜外表面,形成纖突,是重要的保護(hù)性抗原,也是決定鵝源副黏病毒致病力強弱的關(guān)鍵因素[1]。F蛋白能使病毒囊膜與宿主細(xì)胞融合,完成病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合,使病毒穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,并介導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞與相鄰細(xì)胞之間的融合,導(dǎo)致多核巨細(xì)胞或合胞體的產(chǎn)生[2]。隨著對鵝源副黏病毒分子生物學(xué)研究的不斷深入,人們對鵝源副黏病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能及其與致病性關(guān)系的研究有了較大的進(jìn)展[3],發(fā)現(xiàn)不同致病性的鵝源副黏病毒在分子結(jié)構(gòu)上存在差異。特別是對F蛋白的細(xì)胞膜融合功能與致病性關(guān)系的探索性研究,使得人們對不同致病性鵝源副黏病毒的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有了較深入的了解[4]。吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院重要動物病原與疫病研究室從1999年開始對鵝源副黏病毒進(jìn)行研究,至今已從多個層面對鵝源副黏病毒與經(jīng)典的新城疫病毒進(jìn)行了較為系統(tǒng)的比較研究,其中從抗原性[5]、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生學(xué)[6]、受體特異性[7]等方面均表明鵝源副黏病毒與經(jīng)典的新城疫病毒存在差異,而這些差異的重要來源之一是與病毒各自F蛋白的特性密切相關(guān)。本研究對鵝源副黏病毒F蛋白進(jìn)行了酵母表達(dá),為進(jìn)一步在F蛋白結(jié)構(gòu)與功能、致病的分子基礎(chǔ)方面的研究提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 血清Ⅰ型副黏病毒NA-1株為鵝源分離病毒經(jīng)過空斑法純化后由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院重要動物病原與疫病研究室保存[8]。

1.1.2 表達(dá)載體和菌株 pGEM-T載體為 Promega公司產(chǎn)品;畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα A、畢赤酵母表達(dá)宿主菌GS115以及克隆宿主菌 TOP10、Zeocin藥品均為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 Trizol RNA提取試劑盒、T4 DNA連接酶、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000、DL 2 000、DNA片段凝膠回收試劑盒等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶PmeⅠ為New England Biolab公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為Sigma公司產(chǎn)品;培養(yǎng)基YPD、BMGY、BMMY均為BBI公司試劑;酵母菌基因組DNA快速抽提純化試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品;pPICZα A 載體上通用引物5′Pichia primer、3′Pichia primer和 α-Factor sequencing primer的合成和序列測定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.1.4 NA-1陽性血清 由NA-1株病毒經(jīng)4次免疫健康家兔而獲得,其血凝抑制效價為1∶1 024。

1.2 方法

1.2.1 F基因的PCR擴(kuò)增與克隆 根據(jù)GenBank中NA-1株病毒全基因序列(GenBank號DQ659677.1),設(shè)計合成特異性引物,用于F基因片段的擴(kuò)增。F1:5′-TGAGAATTCATGGGCTCCAAACCTTCTACC-3′;F2:5′-GACGTCGACTCATGCTCTTGTA GTGGCTCT-3′;并在上、下游引物中分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(下劃線部分表示),并各加3個保護(hù)性堿基。使用Trizol RNA提取試劑盒提取病毒RNA,PCR擴(kuò)增F基因,用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的F基因片段與pGEMT載體16℃連接過夜,并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TOP10;用F基因特異性引物和EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定來篩選陽性重組質(zhì)粒pT-F并測序。

1.2.2 酵母表達(dá)載體pPICZα A-F的構(gòu)建和鑒定 將鑒定正確的pT-F與pPICZα A用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后,分別回收目的片段和載體大片段進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞,用含Zeocin(25 mg/L)的低鹽LB平板篩選培養(yǎng)。陽性重組質(zhì)粒pPICZα A-F的鑒定和篩選方法如下:用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定,用F基因特異性引物、pPICZα A 上通用引物5′Pichia primer和3′Pichia primer以及 pPICZα A 上通用引物 α-Factor sequencing primer和3′Pichia primer進(jìn)行 PCR 鑒定。

1.2.3 pPICZα A-F的線性化和酵母菌的電擊轉(zhuǎn)化用PmeⅠ對陽性重組質(zhì)粒pPICZα A-F進(jìn)行線性化,純化回收線性化片段。取10 μg線性DNA與冰預(yù)冷的酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115混勻,轉(zhuǎn)入Bio-RAD 610型1.0 mm電擊杯中,用Bio-RAD Gene Pluser電轉(zhuǎn)儀在 375 V/cm 、25 μ F 、250 Ω的條件下進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。按Invitrogen公司操作手冊對酵母重組子進(jìn)行篩選。提取酵母基因組DNA,用F基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,篩選出陽性的GS115整合子用于誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 酵母重組子的甲醇誘導(dǎo)表達(dá) 陽性菌落接種于10 mL BMGY培養(yǎng)基中,28℃～30℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0～6.0,離心收集菌體,用BMMY培養(yǎng)基重懸(OD600≈1.0),在1L培養(yǎng)瓶中,28℃～30℃,180 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d,每隔24 h補加 100%甲醇溶液至其終濃度為10 mL/L,每隔24 h取出1 mL樣品用于表達(dá)產(chǎn)物檢測。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析 取誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)物上清,經(jīng)10 000 r/min,離心10 min,取上清與等體積的二倍上樣緩沖液混勻,100℃煮沸5 min,通過SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá),然后進(jìn)行Western blot檢測,一抗為抗NA-1陽性血清,二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG。

2 結(jié)果

2.1 F基因的擴(kuò)增與克隆

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,F基因片段PCR產(chǎn)物與預(yù)期的1 662 bp大小相符(圖1);回收目的DNA片段,將其克隆到pGEM-T載體中,用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切得到3 000 bp、1 662 bp兩條片段,與預(yù)期大小相符(圖2)。

圖1 NA-1株病毒F基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification of NA-1 F gene

圖2 pT-F質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid pT-F by enzyme digestion

2.2 重組質(zhì)粒pPICZα A-F的鑒定

重組子pPICZα A-F用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切,得到3 545 bp和 1 680 bp兩條片段;以重組子pPICZα A-F為模板,用 F基因特異性引物F1和F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可得到1 680 bp大小的核酸片段;用 pPICZα A 上通用引物5′Pichia primer和3′Pichia primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可得到2 218 bp大小的核酸片段;用pPICZα A 上通用引物 α-Factor sequencing primer和 3′Pichia primer進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,可得到1 929 bp大小的核酸片段;結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖3),表明重組質(zhì)粒pPICZα A-F構(gòu)建正確。

2.3 重組酵母的篩選與鑒定

電轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115,用酵母菌用試劑盒提取基因組DNA,以酵母基因組DNA為模板,用F基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1 680 bp大小的條帶與理論值大小相符的條帶,表明重組酵母表達(dá)質(zhì)粒成功的整合到酵母染色體DNA中。經(jīng)鑒定篩選得到的陽性重組酵母菌3株(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒pPICZα A-F的酶切和PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plamid pPICZα A-F by enzyme digestion and PCR

圖4 重組酵母菌PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of recombinant P.pastoris GS115 by PCR

2.4 重組蛋白SDS-PAGE及Western blot檢測

3株重組酵母菌經(jīng)10 mL/L甲醇誘導(dǎo)7 d,每隔24 h取樣,離心后取上清,進(jìn)行SDS-PAGE檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)24 h后F重組蛋白就有表達(dá),至第7天的重組酵母菌培養(yǎng)基上清中均能檢測到相對分子質(zhì)量為63 ku的目的蛋白,與預(yù)期值相符。Western blot分析結(jié)果顯示,重組酵母菌表達(dá)的重組蛋白可與NA-1多克隆抗體發(fā)生特異性血清反應(yīng)(圖5)。

3 討論

自1997年鵝副黏病毒病首先在江蘇[9]暴發(fā)以來,給我國的養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1999年本研究室[8]在吉林省農(nóng)安縣分離到感染鵝的禽副黏病毒強毒株,經(jīng)病毒的分離、鑒定,確定其分類地位為副黏病毒科,命名為NA-1株,以嗜內(nèi)臟速發(fā)型和嗜神經(jīng)速發(fā)型為主。本研究室已在流行病學(xué)[10]、免疫學(xué)[5]、全基因組水平[11]、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生學(xué)[6]、受體特異性[7]等方面,證實NA-1株鵝源副黏病毒與經(jīng)典的新城疫病毒F48E9存在較大變異。這些新情況的出現(xiàn)說明禽副黏病毒在我國的流行又出現(xiàn)了新的變化,其致病性和抗原性發(fā)生了新的改變。全基因組測序表明,NA-1株病毒F基因全長1 662 bp,編碼553個氨基酸,其分子質(zhì)量約為59 338 u[11]。含有6個糖基化位點,12個半胱氨酸殘基,而且這些糖基化位點和半胱氨酸殘基的位置與NDV F48E9相同,說明F基因的糖基化位點和半胱氨酸殘基是高度保守的。F蛋白有3個強疏水區(qū),第1個疏水區(qū)位于1～25個氨基酸殘基處,為F蛋白N端信號肽區(qū),第2個疏水區(qū)位于117～142氨基酸殘基處,為融合誘導(dǎo)區(qū),該區(qū)域正好是F1 N端,當(dāng)F0裂解產(chǎn)生F1和F2后,F1 N端直接參與膜融合,第3個疏水區(qū)位于500～522氨基酸殘基處,與蛋白的胞質(zhì)區(qū)相鄰,為蛋白跨膜區(qū),具有終止蛋白轉(zhuǎn)移和膜錨定功能[12]。

圖5 F基因在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of culture broth of F gene expressed in P.pastoris GS115

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種近年來廣泛使用的真核表達(dá)系統(tǒng),具有大腸埃希菌操作簡單、生長速度快、易于高密度發(fā)酵且培養(yǎng)成本低的優(yōu)點,又有真核細(xì)胞翻譯后修飾加工,能形成正常的二硫鍵和較為合理的糖基化的特點,使外源蛋白更具有天然的生物學(xué)活性。本試驗表達(dá)產(chǎn)物約為63 ku,F0蛋白由553個氨基酸組成,在哺乳動物細(xì)胞中完全糖基化后的分子質(zhì)量為68 ku,本研究室前期利用昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也成功的進(jìn)行了F基因的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的大小也約為63 ku[13],這說明在在兩種表達(dá)系統(tǒng)中,合成的蛋白都可以糖基化,但均屬于不完全糖基化。畢赤酵母對外源蛋白的糖基化修飾也比較合理,不會產(chǎn)生過度糖基化。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是外源基因通過同源重組整合到宿主菌的染色體上的,因而構(gòu)建的表達(dá)菌株穩(wěn)定性很高,可穩(wěn)定培養(yǎng)100代以上,畢赤酵母表達(dá)載體具有的信號肽,能將外源蛋白分泌到胞外,而酵母內(nèi)源蛋白分泌到胞外的組分很少,有利于目的蛋白的純化。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot分析證實該表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。由于F蛋白是副黏病毒感染宿主細(xì)胞時發(fā)生細(xì)胞融合的關(guān)鍵蛋白,因此,該表達(dá)產(chǎn)物可為進(jìn)一步研究病毒與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合的機(jī)制提供基礎(chǔ)材料。

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Expression of Fusion Protein of Goose Paramyxovirus inPichia pastoris

FENG Xin1,SONG Zhan-yun2,LIU Yang2,ZHANG Qiong3,JIANG Yong-li2,DING Zhuang1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,J ilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China;
2.J ilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Changchun,J ilin,130062,China;
3.Liaoning Entry-Exit inspection and Quarantine Bureau,Dalian,Liaoning,116001,China)

To express F protein of NA-1 inPichia pastoris,F gene was amplified by RT-PCR from NA-1 with a pair of specific primers.Then PCR product was purified and cloned into pGEM-T vector to obtain the plasmid pT-F.The gene fragment was recovered after the double enzyme digestion withEcoRⅠandNotⅠ ,then was subcloned into pPICZαA.The recombinant pPICZα A-F was linearized withPmeⅠ and then transformed into GS115 yeast cells for expression.The recombinant strains were screened by PCR technique.The expression products were identified by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that there was a molecular weight of 63 ku protein specifically recognized by polyclonal antibody against NA-1.It suggested that the F protein of NA-1 was obtained inPichia pastorisexpression system.

Goose paramyxovirus;F protein;Pichia pastoris;expression

S852.659.5

A

1007-5038(2010)09-0007-05

2010-06-08

國家自然科學(xué)基金項目(30771606;30901069)

馮 新(1978-),女,內(nèi)蒙古赤峰人,講師,博士研究生,主要從事獸醫(yī)微生物和免疫學(xué)研究。