龔玉梅,張培君*,朱文革,孫惠玲,王宏俊,賀云霞,邵慶紅,徐 慧

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097;.2.北京信得威特科技有限公司,北京 101302)

雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫苗安全性試驗(yàn)和效力檢驗(yàn)初報(bào)

龔玉梅1,張培君1*,朱文革2,孫惠玲1,王宏俊1,賀云霞1,邵慶紅2,徐 慧1

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097;.2.北京信得威特科技有限公司,北京 101302)

利用Page A、B、C型副雞禽桿菌,研制雞傳染性鼻炎(IC)三價(jià)滅活疫苗。用6批IC疫苗進(jìn)行了大劑量單次接種和單劑量多次接種的安全性試驗(yàn),結(jié)果表明,IC三價(jià)滅活疫苗安全無(wú)副作用;用3批疫苗進(jìn)行SPF雞和普通雞的免疫效力試驗(yàn),結(jié)果對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率≥80%;商品雞42日齡首免,110日齡二免,二免后約9個(gè)月對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率≥80%;用4℃～8℃保存一年的3批疫苗進(jìn)行了SPF雞的近期免疫效力試驗(yàn),結(jié)果對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率≥80%。

雞傳染性鼻炎;三價(jià)滅活疫苗;安全性試驗(yàn);效力試驗(yàn)

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza IC)是由副雞禽桿菌[(Avibacterium paragallinarum,Apg),以前稱副雞嗜血 桿菌 (Haemophilus paragallinarum,Hpg)]引起的上呼吸道傳染病[1-2],主要影響蛋雞的產(chǎn)蛋(產(chǎn)蛋下降10%～40%)和肉雞的肉質(zhì)[2]。本病存在于世界各國(guó),給養(yǎng)雞業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。

副雞禽桿菌有A、B、C 3個(gè)血清型。我國(guó)于1986年由馮文達(dá)分離到A型副雞禽桿菌[3-8],1995年林毅分離到C型副雞禽桿菌[9-11],2002年和2005年,張培君和孫惠玲分別分離到B型副雞禽桿菌[12-14]。以前有報(bào)道認(rèn)為B型副雞禽桿菌不致病,但張培君和孫惠玲的報(bào)道[12-14]表明B型副雞禽桿菌有較強(qiáng)的致病性。

為有效防控雞傳染性鼻炎,參照雞傳染性鼻炎(A型)油佐劑滅活疫苗[15]、雞傳染性鼻炎(A+C型)-新城疫二聯(lián)油佐劑滅活疫苗的研究方法和制作工藝[16],研制了9批雞傳染性鼻炎三價(jià)(A+B+C)油乳劑滅活疫苗,現(xiàn)將有關(guān)批次疫苗的安全性試驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、保存期試驗(yàn)和免疫持續(xù)期試驗(yàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制苗和攻毒用菌株 A型菌為C-Apg-8(CVCC254株),B型菌為北京株(分離株),C型菌為Apg-668株。這3個(gè)菌株均保存在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 雞血清雞肉湯,雞血清雞肉湯瓊脂,半合成培養(yǎng)基等均參照本實(shí)驗(yàn)室以前的配方[15-16],并添加一定含量的還原型輔酶I(NADH)。

1.1.3 試劑 司本-80和吐溫-80,為上海申宇醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品;硬脂酸鋁,為上海遠(yuǎn)航試劑廠產(chǎn)品;白油為杭州煉油廠10號(hào)白油。

1.1.4 SPF雞 購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.5 父母代商品雞 購(gòu)自北京華都集團(tuán)峪口祖代種雞場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備 將上述3個(gè)菌株分別接種雞血清雞肉湯瓊脂平皿,放37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)16 h～18 h,挑取典型菌落分別接種半合成培養(yǎng)基,培養(yǎng)16 h～48 h,純檢,加入2.5 mL/L的福爾馬林滅活,離心集菌,與油乳劑按照1∶1制備成疫苗[15-16],此疫苗約含A型菌6.0×108cfu/mL,B型菌1.0×109cfu/mL,C型菌8.0×108cfu/mL。9批疫苗的批號(hào)為 200601、200602和 200603;200701、200702和200703;200801、200802 和 200803。

1.2.2 安全性試驗(yàn) 130只18日齡SPF雞,飼養(yǎng)在北京信得威特科技有限公司的SPF雞隔離器內(nèi),觀察3 d,將雞隨機(jī)分成13組,每組10只,第1組至第6組為大劑量注射組,分別注射200601、200602和200603;200701、200702和200703六批疫苗,每只雞胸部肌肉注射疫苗2.0 mL,注射后觀察14 d。第7至第12組為單劑量多次注射組,分別注射上述6批疫苗,每只雞胸部肌肉注射0.5 mL,3 d后進(jìn)行第2次注射,再3 d后進(jìn)行第3次注射,于第3次注射后再觀察14 d。主要觀察接種雞的精神狀態(tài)、飲水和采食等情況。第13組為非接種對(duì)照組,其觀察時(shí)間與第7至第12組相同。

1.2.3 SPF雞近期效力試驗(yàn)

1.2.3.1 免疫 120只28日齡SPF雞,飼養(yǎng)在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所SPF隔離器內(nèi),觀察14 d,至42日齡時(shí)隨機(jī)分成4組,每組30只雞,試驗(yàn)組用在 4℃～8℃保存 3個(gè)月的三批疫苗200801、200802和200803免疫接種,每只雞分別胸部肌肉注射0.5 mL疫苗,第4組為非免疫對(duì)照組。

1.2.3.2 攻毒 免疫30 d后,試驗(yàn)組和對(duì)照組各取10只雞分別攻擊A、B、C型副雞禽桿菌,每只雞的攻毒劑量為A型5.0×105cfu/0.2 mL,B型2.0×105cfu/0.2 mL,C型5.0×105cfu/0.2 mL,攻毒部位為眶下竇內(nèi)注射。攻毒后觀察7 d[15-17]。

1.2.4 普通雞二免持續(xù)期試驗(yàn)

1.2.4.1 首次免疫 200只1日齡海蘭褐父母代雛雞,購(gòu)自無(wú)雞傳染性鼻炎病史的祖代雞場(chǎng),飼養(yǎng)在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物舍,14日齡免疫接種法氏囊活疫苗,21日齡免疫接種新城疫活疫苗,28日齡第2次免疫接種法氏囊活疫苗,42日齡時(shí)隨機(jī)分成4組,每組50只雞,第1～3組為免疫組,分別用4℃～8℃保存4個(gè)月的3批疫苗(200801、200802和200803)進(jìn)行首次免疫接種,每只雞胸部肌肉注射接種0.5 mL疫苗。第4組為非免疫對(duì)照組。所有200只雞同時(shí)被接種雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗0.5 mL(本所姜北宇研究員饋贈(zèng))。

1.2.4.2 二免 首免后76 d(118日齡)[15-16],用上述4℃～8℃保存200 d的3批疫苗對(duì)第1～3組雞進(jìn)行第2次免疫,每只雞胸部肌肉接種0.5 mL疫苗。所有200只雞同時(shí)第二次接種雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗0.5 mL。

1.2.4.3 攻毒 第二次免疫接種后35 d和200 d,3個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組各取15只雞分別攻擊A、B、C型副雞禽桿菌,余下的雞只(養(yǎng)殖過(guò)程中,有幾只雞因產(chǎn)蛋難憋死)于第2次免疫后270 d,分別攻擊A、B、C型副雞禽桿菌。攻毒劑量均為每只雞A型5.0×105cfu/0.2 mL,B型 2.0×105cfu/0.2 mL,C型5.0×105cfu/0.2 mL。3次攻毒劑量相同,攻毒部位為眶下竇內(nèi)注射。攻毒后觀察7 d[15-17]。

1.2.5 保存期試驗(yàn) 120只42日齡SPF雞,隨機(jī)分成4組,第1～3組用4℃～8℃保存1年的3批三價(jià)疫苗(200801,200802和200803)免疫接種,每只雞胸部肌肉內(nèi)接種0.5 mL疫苗,免疫接種后30 d,所有120只雞分別攻擊A、B、C型副雞禽桿菌。攻毒劑量為每只雞A型5.0×105cfu/0.2 mL,B型2.0×105cfu/0.2 mL,C型5.0×105cfu/0.2 mL。攻毒部位為眶下竇內(nèi)注射,攻毒后觀察7 d[15-17]。

2 結(jié)果

2.1 安全性試驗(yàn)

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),所有130只雞均健康存活。除大劑量接種組(第1～6組)在接種的當(dāng)天有部分雞只采食減少外無(wú)其他不良反應(yīng);大劑量接種組第4～6組部分雞只在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)疫苗沒(méi)有被完全吸收。單劑量多次接種組(第7～12組)沒(méi)有任何不良反應(yīng)(表1,表2)。

2.2 SPF雞近期效力試驗(yàn)

攻毒后的第 2日,A型和B型對(duì)照組雞只均10/10發(fā)病,表現(xiàn)為眶下竇腫脹明顯,流鼻液,免疫組均10/10保護(hù);C型對(duì)照組8/10發(fā)病,癥狀比A型和B型對(duì)照組輕,免疫接種組為10/10、10/10和9/10保護(hù)。攻毒后的第2日和第3日,A型和B型對(duì)照組有部分雞只呈一過(guò)性失明。C型對(duì)照組為9/10發(fā)病。免疫組有1只～2只雞只發(fā)病。觀察至第7日,詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 大劑量接種組Table 1 High dose inoculated groups

表2 單劑量多次接種組Table 2 T he groups inoculated with sing le dose for 3 times

表3 IC三價(jià)滅活疫苗SPF雞近期效力試驗(yàn)Table 3 T he potence test of vaccine in SPF chicken

2.3 普通雞二免持續(xù)期試驗(yàn)

2.3.1 普通雞二免后35 d攻毒結(jié)果 二免后35 d,每組取15只雞分別用A、B、C型Apg進(jìn)行攻毒,攻毒后觀察7 d。在攻毒24 h后,所有15只對(duì)照雞均呈現(xiàn)明顯的雞傳染性鼻炎臨床癥狀(眶下竇和面部腫脹,鼻道分泌物為黏液性,鼻液多),不食、飲水量比免疫雞明顯減少。攻毒后48 h和72 h,所有非免疫對(duì)照雞只的臨床癥狀與攻毒后24 h相同。整個(gè)觀察期間,3個(gè)免疫組的雞只對(duì)A型為15/15(100%)保護(hù),而對(duì)B型和C型菌株的攻擊,每組均有1只雞發(fā)病,其癥狀比非免疫對(duì)照組明顯為輕(表4)。

表4 普通雞二免后35 d攻毒結(jié)果Table 4 Challenge test 35 days after second immunization in chickens

2.3.2 普通雞二免后200 d和270 d攻毒結(jié)果 二免后200 d,每組取15只雞分別用A 、B、C型Apg進(jìn)行攻毒,攻毒后觀察7 d;二免后270 d,每組余下的雞只分別用A、B、C型Apg進(jìn)行攻毒,攻毒后亦觀察7天。結(jié)果表明,普通雞只在42日齡接種IC三價(jià)滅活疫苗0.5 mL,110日齡再次接種IC三價(jià)滅活疫苗0.5 mL,二免后 200 d和270 d,對(duì)A 、B、C 型Apg均能夠獲得良好保護(hù)(表5,表6)。

表5 普通雞二免后200 d攻毒結(jié)果Table 5 Challenge test 200 days after second immunization in chickens

2.4 三價(jià)滅活疫苗的保存期試驗(yàn)

用4℃～8℃保存1年的3批IC三價(jià)滅活疫苗免疫接種42日齡SPF雞只,免疫接種后30 d,所有雞只分別用A、B、C型Apg進(jìn)行攻毒,攻毒劑量和部位同前述。攻毒后觀察7 d(表7)。結(jié)果表明,IC三價(jià)滅活疫苗在4℃～8℃保存1年后免疫接種雞只,其免疫效力不變。

表6 普通雞二免后270 d攻毒結(jié)果Table 6 Challenge test 270 days after second immunization in chickens

表7 疫苗保存期試驗(yàn)Table 7 The storage period test of the vaccines

3 討論

疫苗的安全性和有效性是評(píng)價(jià)疫苗的兩個(gè)重要指標(biāo),本試驗(yàn)按照農(nóng)業(yè)部有關(guān)新制品的研制要求進(jìn)行了安全性試驗(yàn),3批疫苗(200601,200602,200603)在實(shí)驗(yàn)室制備,3批疫苗(200701,200702,200703)在符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的車間制備,此6批疫苗無(wú)論是大劑量接種還是單劑量多次接種,對(duì)雞只沒(méi)有副反應(yīng),表明雞傳染性鼻炎三價(jià)油乳劑滅活疫苗安全性良好。第4～6組部分雞只在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)疫苗沒(méi)有被完全吸收,可能與疫苗的黏度較大吸收緩慢有關(guān)。

鑒于副雞禽桿菌的生物學(xué)特性和雞只的個(gè)體差異,不能保證每一次試驗(yàn)非免疫雞只人工感染后100%發(fā)病(表3和表7攻擊C型的對(duì)照雞就有1/10和2/10的雞沒(méi)有發(fā)病),也不能保證每一次試驗(yàn)免疫雞只人工感染后100%獲得保護(hù)(我們所獲得的B型和C型菌株有限,現(xiàn)有菌株的免疫原性很難達(dá)到非常理想狀態(tài))。為科學(xué)地評(píng)價(jià)IC滅活疫苗的免疫效力,在A、B、C型副雞禽桿菌對(duì)SPF雞只致病力試驗(yàn)的基礎(chǔ)上(有關(guān)論文將另外發(fā)表),結(jié)合有關(guān)IC疫苗的數(shù)據(jù)[15-17],我們擬訂了IC滅活疫苗的效檢標(biāo)準(zhǔn),42日齡以上雞只免疫1個(gè)月后攻毒,攻毒劑量為A型5.0×105cfu/0.2 mL,B型2.0×105cfu/0.2 mL,C型5.0×105cfu/0.2 mL,攻毒部位為眶下竇內(nèi)注射,攻毒后觀察7 d～14 d[9],非免疫對(duì)照雞只發(fā)病率≥4/5(8/10)、免疫雞只發(fā)病率≤1/5(2/10),疫苗判為合格。

依據(jù)上述判定標(biāo)準(zhǔn),200801、200802和200803三批疫苗對(duì)SPF雞只的近期免疫效力,普通雞只二免后35、200、270 d的攻毒結(jié)果,免疫雞攻擊 A型僅有3只雞發(fā)病,總保護(hù)率達(dá)到99/102(97%),進(jìn)一步證明A型菌株C-Apg-8(CVCC254株)免疫原性良好,免疫雞對(duì)B型和C型菌株的攻毒保護(hù)率也均達(dá)到≥8/10或≥4/5,表明疫苗免疫效果良好。

保存期試驗(yàn)結(jié)果表明,IC三價(jià)滅活疫苗在4℃～8℃保存1年,其免疫原性不受影響。

IC三價(jià)滅活疫苗的安全性和免疫原性有待于田間進(jìn)一步驗(yàn)證。

初步試驗(yàn)結(jié)果表明,我們研制的IC三價(jià)滅活疫苗安全性和免疫原性良好。

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Safety and Efficacy Study on Trivalencs Inactivated Vaccines Against Infectious Coryza

GONG Yu-mei1,ZHANG Pei-jun1,ZHU Wen-ge2,SUN Hui-ling1,WANG Hong-jun1,HE Yun-xia1,SHAO Qing-hong2,XU Hui1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Beijing Academy of Agricultural and Forestry Science,Beijing,100097,China;2.Beijing Sinder Vet-Technology CO.,L TD.Shunyi,Beijing,101302,China)

Using Page's serovar A,B and C ofAvibacterium paragallinarum,trivalent inactived oil-emulsion vaccine against infectious coryza was prepared.Six batches of vaccines used for safety test.2.0 mL/chicken was injected at a time and 0.5mL/chicken at a time for three times.Any side effects were not found.The results showed the vaccines were safeThe vaccine efficacy experment with three batches of vaccines in SPF chicken,30 days after immunization,the chickens were challenged with Page's serovar A,B and C ofAvibacterium paragallinarum.The protection rate≥80%in immunized chickens.The commodity chicken were immunized at 42 days old and 110 days old.Nine months after second immunization,the chickens were challenged,the protection rate≥80%in immunized chickens.The SPF chickens were immunized with three batch of vaccines which were stored at 4-8℃for 12 months,30 days after immunization,the chickens were challenged with Page's serovar A,B and C ofAvibacterium paragallinarum,The protection rate≥80%in immunized chickens.

Infectious coryza;trivalence inactived vaccine;safety test;potency test

S852.613

A

1007-5038(2010)03-0039-05

2009-09-14

北京市科委產(chǎn)業(yè)化重點(diǎn)項(xiàng)目(Z07010501780701)

龔玉梅(1961-),女,湖南華容人,高級(jí)獸醫(yī)師,主要從事動(dòng)物疫病診斷與預(yù)防工作。*通訊作者