張 玲,包靜月,李 林,王志亮*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家外來動物疫病診斷中心,山東青島 266032)

RT-PCR鑒別小反芻獸疫病毒疫苗株與強(qiáng)毒株方法的建立

張 玲1,2,包靜月1,李 林1,王志亮1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家外來動物疫病診斷中心,山東青島 266032)

根據(jù)GenBank中公布的小反芻獸疫病毒的H基因或全基因序列,利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增片段長度為477 bp,建立區(qū)分小反芻獸疫疫苗毒與基因4系野毒的RT-PCR檢測方法,并用于臨床檢測。結(jié)果表明,建立的RT-PCR鑒別診斷方法能特異性區(qū)分疫苗株Nigeria 75/1與基因4系PPRV,與基因3系、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒等同屬病毒無交叉反應(yīng);最低可以檢測到濃度為7.7×10-5ng/μ L的RNA模板;該方法操作簡單,耗時(shí)短,可以初步用于臨床鑒別診斷。

RT-PCR;鑒別;小反芻獸疫病毒

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的發(fā)生于山羊和綿羊的一種以發(fā)熱、口腔壞死性內(nèi)膜炎、腸炎、高發(fā)病率和高死亡率為特征的急性接觸性傳染病。PPR病毒是副黏病毒科(Paramy xoviridae)麻疹病毒屬(Morbolivirus)成員,同屬的其他成員還有牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV),犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV),海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus,PDV)[1-3]。PPRV是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報(bào)告的傳染病,我國規(guī)定為一類動物疫病。山羊和綿羊是PPR的惟一自然宿主,山羊比綿羊更易感,且臨床癥狀比綿羊更為嚴(yán)重,具有極高的發(fā)病率和死亡率,野生小反芻動物也可感染發(fā)病死亡,目前尚無人感染該病的報(bào)告。PPR一旦暴發(fā),將會給國家的小反芻獸的國內(nèi)流動和國際貿(mào)易,同時(shí)對相關(guān)的動物制品如羊毛,羊絨,羊皮等產(chǎn)品的出口帶來困難,從而給國家和農(nóng)牧民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。PPRV只有一個(gè)血清型,從遺傳演化上,可分為四個(gè)基因系,基因1系分布在西非;基因2系分布在非洲北部的尼日利亞,喀麥隆;基因3系主要分布在東非;基因4系主要分布在中東和西亞?？梢哉J(rèn)為該病毒在漫長的由西部向東部傳播過程中,亞型發(fā)生著從1-2-3-4的轉(zhuǎn)變[6-7],我國西藏阿里地區(qū)流行的毒株均為4系,與周邊國家一致[8]。

目前對于小反芻獸疫尚無有效的治療方法,主要還是依靠疫苗免疫防控。1989年,通過在Vero細(xì)胞上的連續(xù)傳代,成功將Nigeria75/1株致弱。試驗(yàn)證明Nigeria75/1株能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對PPRV的抗體,有效預(yù)防PPRV強(qiáng)毒的感染,對羊沒有副作用,并且保護(hù)性抗體可以持續(xù)3年以上。雖然Nigeria75/1株屬于基因2系毒株,但對其他3個(gè)系的強(qiáng)毒同樣具有高的保護(hù)率[9]。我國西藏地區(qū)發(fā)生小反芻獸疫后,對疫區(qū)及周邊地區(qū)進(jìn)行免疫接種的疫苗均為小反芻獸疫弱化毒株Nigeria75/1[10]。該疫苗為我國乃至全世界的小反芻獸疫的控制做出了重要的貢獻(xiàn)。但是弱毒株的存在會干擾PPR的血清學(xué)調(diào)查,導(dǎo)致無法與野毒感染進(jìn)行區(qū)分。近年來應(yīng)用RT-PCR、PCRELISA等檢測方法,對小反芻獸疫病毒進(jìn)行快速檢測并且區(qū)分PPR和RP的診斷方法早有報(bào)道,但是這些檢測方法都不能鑒別區(qū)分野毒和疫苗毒。本試驗(yàn)建立了區(qū)分疫苗毒和基因4系野毒株的RT-PCR方法,希望能夠?yàn)閷淼男》雌c獸疫病毒的檢測提供積極有效的技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與病料 所用毒株有3系Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株,基因4系 Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株均為英國動物衛(wèi)生Pirbright實(shí)驗(yàn)室 Tom Barrette教授惠贈。Nigeria75/1、CDV、PPRV/China/Tibet/07分離株均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家外來疫病診斷中心保存。西藏阿里地區(qū)送檢的臨床RNA樣品29份(-70℃保存?zhèn)溆?。

1.1.2 試劑 One step prime script RT-PCR kit DNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;Trizol reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品;DEPC為Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均有國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中公布的關(guān)于PPRV的H基因序列或全基因序列,利用Meg A-lign(DNA Star),Primer Premier 5.0軟件在H基因變異性最大的區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物 H1a/H2b。擴(kuò)增片段的長度為477 bp。由寶生物工程(大連)有限公司合成。DEPC處理過的水溶解至100 μ L 。

PPRVH1a:CCT GGA TAG AGA ACG CT T GGTC;PPRVH2b:CCG AGA GTC AAT GAT TGC AGCT。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化 RT-PCR反應(yīng)體系(25 μ L)如下:2 ×1 step buffer 12.5 μ L,1 μ L正向引物為 PPRV H1a(10 μ mol/L),1 μ L 反向引物為 PPRV H2b(10 μ mol/L),1 μ L Prime script Enzyme Mix,6.5 μ L RNA Enzyme Free H2O,模板RNA 3 μ L。擴(kuò)增和檢測反應(yīng)條件為:50 ℃,30 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;94℃,2 min進(jìn)行Taq酶激活;94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,40個(gè)循環(huán);72℃7 min延伸。擴(kuò)增反應(yīng)后用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳,觀察片段大小。

1.2.3 靈敏度試驗(yàn) 取200 μ L China/Tibet/07感染的Vero細(xì)胞,提取 RNA。用Nano Drop(ND1000 Spectrophotometer)濃度測定儀確定其濃度為77 ng/μ L,然后按 10 倍遞增稀釋至 10-7ng/μ L,反轉(zhuǎn)錄后,用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 以China/Tibet/07株,Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株,Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株及CDV的RNA為模板,DEPC水為空白對照,Vero細(xì)胞為陰性對照。用引物H1a/H2b進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)束后用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.5 樣品檢測 調(diào)整上述PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增條件,摸索出該引物的最適合條件。然后對西藏阿里地區(qū)送檢的來自29頭疑似發(fā)病羊的29份組織的核酸樣品進(jìn)行檢測。用本試驗(yàn)方法和OIE規(guī)定的國際標(biāo)準(zhǔn)N-based RT-PCR檢測技術(shù),同時(shí)對這29份樣品進(jìn)行檢測,并計(jì)算該試驗(yàn)的相對敏感性與相對特異性。相對敏感性與相對特異性的計(jì)算方法如下:

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

為獲得該對引物最佳擴(kuò)增效果和最高敏感性,對引物擴(kuò)增的條件進(jìn)行了摸索和調(diào)整,梯度性地改變變性溫度和時(shí)間,退火溫度和時(shí)間,延伸時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等條件,最終確定了H1a/H2b的最佳擴(kuò)增條件為50℃,30 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;94℃,2 min;94℃1 min,60℃45 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

用 RT-PCR方法擴(kuò)增濃度為 77 ng/μ L的RNA模板和稀釋模板 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000均出現(xiàn)明顯的目的條帶,即檢測到的目的基因的最低 RNA模板量為7.7×10-5ng/μ L(圖1)。

圖1 China/Tibet/07/PPRV RT-PCR敏感性試驗(yàn)Fig.1 Sensitivity assay of China/Tibet/07/PPRV by RT-PCR

2.3 特異性試驗(yàn)

對以上毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明,只有基因4系China/Tibet株,Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株的PCR產(chǎn)物在500 bp位置有一條與預(yù)計(jì)大小相符的條帶,而基因2系Nigeria75/1疫苗株,基因3系Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株,CDV及空白、陰性對照均無條帶(圖2)。

2.4 樣品檢測

臨床檢測結(jié)果表明,本試驗(yàn)方法檢測為陽性的樣品,再用OIE國際規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)N-based RT-PCR方法檢測,也均為陽性。兩種方法的檢測結(jié)果完全一致。其中16頭羊?yàn)殛栃?13頭羊?yàn)殛幮?測得相對敏感性與相對特異性均為100%。

圖2 RT-PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR specific amplification results

3 討論

小反芻獸疫是一種發(fā)病率和死亡率很高的急性病毒病。雖然使用弱化毒株 Nigeria75/1進(jìn)行免疫,可以使動物獲得3年以上的免疫力,但是該疫苗的廣泛應(yīng)用,會嚴(yán)重干擾我國小反芻獸疫的血清學(xué)調(diào)查。疫苗研究的一個(gè)重要方面就是要建立能夠區(qū)分疫苗感染動物與自然感染動物的診斷方法。然而目前并沒有關(guān)于區(qū)分小反芻獸疫疫苗毒和野毒的檢測方法報(bào)道。采取RT-PCR方法對野毒和弱毒進(jìn)行鑒別診斷報(bào)道已經(jīng)很多,如臺灣的Shiow-Suey Lai等運(yùn)用RT-PCR方法鑒別豬瘟野毒和三株豬瘟兔化弱毒苗[11],趙耘等[12-13]采用RT-PCR和酶切方法區(qū)分豬瘟疫苗毒與野毒,馬文軍等[14]運(yùn)用 RTPCR方法區(qū)分偽狂犬野毒株和基因缺失苗等等一系列相關(guān)報(bào)道,為本研究提供了豐富的理論和技術(shù)背景。

小反芻獸疫的H基因全長為1 852 bp,ORF為1 827 bp,編碼609個(gè)氨基酸。H蛋白為糖蛋白,而且是麻疹病毒屬中最易變異的蛋白[9]。本研究就是利用H基因變異性大的特點(diǎn),通過對基因2系Nigeria75/1弱毒疫苗,基因4系野毒株(China/Tibet/07分離株,Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株),基因 3系野毒株(Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株),以及 RPV/RBOK株,RPV/Russian株,CDV的H基因進(jìn)行分析,針對變異較為活躍的區(qū)域(位點(diǎn)為92 nt～113 nt,568 nt～547 nt),設(shè)計(jì)了擴(kuò)增片段大小為477 bp的引物H1a/H2b。試驗(yàn)結(jié)果證明該引物專一性強(qiáng),不僅能夠準(zhǔn)確的區(qū)分基因4系野毒株與基因2系Nigeria75/1弱毒株,而且不與基因3系毒株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株,CDV發(fā)生交叉反應(yīng)。該 RT-PCR方法可檢測到的最低模板量可達(dá)7.7×10-5ng/μ L,該值完全可以滿足作為診斷方法的要求。臨床應(yīng)用中,用本試驗(yàn)方法檢測的結(jié)果與OIE國際標(biāo)準(zhǔn)N-based RTPCR檢測法的結(jié)果完全一致。綜上所述,該試驗(yàn)使用的引物,可以成功的擴(kuò)增出國內(nèi)流行的毒株,特異性好,靈敏度高,準(zhǔn)確度高,因此有潛力用于獸醫(yī)臨床小反芻獸疫病毒的篩查和鑒別診斷。

[1]駱學(xué)農(nóng),鄭亞東,才學(xué)鵬.小反芻獸疫的研究進(jìn)展[J].中國學(xué)術(shù)期刊文摘,2008(8):3-3.

[2]Gibbs E P.Classification of peste des petits ruminants virus as the fourth member of the genusMorbillivirus[J].Int Virol,1979,11(5):268-274.

[3]Lefev re P C,Diallo A.Peste des petits ruminants[J].Rev Sci Tech,1990,9(4):935-981.

[4]張喜悅,小反芻獸疫(Ppr)傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)分析[J].中國動物檢疫,2007(10):40-42.

[5]Diallo A.Control of peste des petits ruminants and poverty alleviation[J].Vet Med B Infect Dis Vet Public Health,2006,53(S1):11-13.

[6]Dhar P.Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus(PPRV)[J].Vet Microbiol,2002,88(2):153-159.

[7]Shaila M S.Geographic distribution and epidemiology of peste des petits ruminants virus[J].Virus Res,1996,43(2):149-153.

[8]Wang Z,Bao J.Peste des petits ruminants virus in Tibet,China[J].Emerg Infect Dis,2009,15(2):299-301.

[9]南文金.小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)與疫苗研究進(jìn)展[J].中國動物檢疫,2009(1):62-65.

[10]Diallo A.Control of peste des petits ruminants:classical and new generation vaccines[J].Dev Biol(Basel),2003,114:113-119.

[11]Pan C H.Rapid detection and differentiation of wild-ty pe and three attenuated lapinized vaccine strains of classical swine fever virus by reverse transcription polymerase chain reaction[J].Vet Diagn Invest,2008,20(4):448-456.

[12]趙 耘.RT-PC和酶切方法區(qū)分豬瘟疫苗毒與野毒的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2006(3):82-87.

[13]Ishida S.Sensitive and rapid detection of norovirus using duplexTaqMan reverse transcription-polymerase chain reaction[J].Med Virol,2008,80(5):913-920.

[14]M a W.Development of real-time polymerase chain reaction assays for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies and gene-deleted vaccine viruses[J].Vet Diagn Invest,2008,20(4):440-447.

Establishment of RT-PCR Assay for Differentiation of Vaccine Strain and Wild-type Peste des Petits Ruminants Virus

ZHANG Ling1,2,BAO Jing-yue1,LI Lin1,WANG Zhi-liang1

(1.College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong,266109,China;2.National Diagnostic Center for Exotic Animal Diseases,China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong,266032,China)

Based on the H gene sequence of peste des petits ruminants virus(PPRV)published in GenBank,a pair of special primers were designed by Primer Premier 5.0,the fragment of amplification was 477 bp in length.The establishment of RT-PCR assay aimed to differentiate vaccine and field isolates of 4-type peste des petits ruminants virus.By using the one-step RT-PCR,the wild-type and vaccine strains of PPRV in clinical samples were detected and accurately distinguished.The detection limit concentration of RNA was 7.7×10-5ng/μ L.

RT-PCR;differentiation;Peste des petits ruminants virus(PPRV)

S852.659.5;S854.43

A

1007-5038(2010)03-0017-04

2009-10-13

農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2006-G57(3))

張 玲(1984-),女,山東煙臺人,碩士,主要從事外來動物疫病檢測方法研究。*通訊作者