張宏剛,陳樹林,王曉珊,張文華,孟 霞,唐彩琰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

孕牛血清早孕因子的生物活性檢測及妊娠率分析*

張宏剛,陳樹林*,王曉珊,張文華,孟 霞,唐彩琰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

采用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)(RIT)對17頭人工授精孕牛血清中早孕因子生物活性進(jìn)行檢測,并進(jìn)行了妊娠結(jié)果回訪。結(jié)果顯示,孕牛在排卵后2 d～7 d內(nèi),13頭孕牛血清經(jīng)RIT檢測出早孕因子活性,4頭孕牛血清中經(jīng)RIT未檢測出早孕因子活性。回訪發(fā)現(xiàn)8頭孕牛娩出胎兒,2頭孕牛流產(chǎn),4頭未妊娠,人工受精率為76.47%,妊娠率為58.82%,妊娠至分娩的成功率為47.06%,妊娠早期流產(chǎn)率為11.76%,測出早孕因子活性隨訪未妊娠的植入期胚泡丟失率為23.08%。用RIT對孕牛血清中早孕因子生物活性的研究,對建立早期妊娠診斷方法和檢測早期胚胎發(fā)育情況及確定早期胚胎死亡的方法具有重要參考價值。

玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn);早孕因子;生物活性;檢測;妊娠

Morton H等于1974年首次在大鼠的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性多肽物質(zhì)——早孕因子(early pregnancy factor,EPF)[1-3],并認(rèn)為它是與妊娠相關(guān)的免疫抑制蛋白,可以從妊娠早期母體的孕血清中分離提純[4-5]。通過玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測,早孕因子是母體在受精4 h后,由母體血液釋放出來[6-7]。本試驗(yàn)用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測人工授精孕牛血清中EPF生物活性,觀察孕牛的妊娠情況。人工授精是指用非性交的方法將雄性動物的精液注入到雌性動物生殖道,使卵子與精子自然結(jié)合,以達(dá)到妊娠目的一種生殖技術(shù)。

人工授精法在很多動物中有很多成功的報道。但是,采用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)對人工授精母牛血清EPF生物活性的檢測,在國內(nèi)未見報道。因此,通過人工授精后孕牛血清中EPF活性進(jìn)行分析研究,對進(jìn)一步研究胚胎的形成及生長狀態(tài)具有重要的意義,同時檢測血清中EPF為監(jiān)測胚胎發(fā)育提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性對照血清 取自13例,確診為妊娠的早孕母牛(妊娠4個～5個月)血清。每份血清分別做玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn),測定花環(huán)抑制試驗(yàn)后,混合分裝,置-30 ℃保存,待用 。

1.1.2 陰性對照血清 采集16例無妊娠指征的健康牛血清。血清混合分裝,置-30℃保存,待用。整個試驗(yàn)皆用同一批陽性及陰性血清作為對照,用前56℃,30 min滅活。以上孕牛排卵后2 d～7 d內(nèi)采血,分離血清,分裝,置-30℃保存,56℃,30 min滅活。

1.1.3 儀器設(shè)備與試劑 TDL-4Z電動離心機(jī),常州諾基儀器有限公司產(chǎn)品;恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州南北儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;電熱恒溫水箱,上海比朗儀器有限公司產(chǎn)品;JD-3B系列多功能電子天平,西安萬科重儀器公司產(chǎn)品。生理鹽水,肝素鈉抗凝劑,臺盼蘭,D-Hanks平衡鹽溶液等。

1.2 方法

1.2.1 采集人工授精孕牛排卵后2 d～7 d內(nèi)的待測血清 對17頭牛進(jìn)行人工授精,其中有12頭為排卵期正常的妊娠孕牛,5頭為不孕癥治療過程中調(diào)整卵巢功能后有排卵發(fā)生的的妊娠孕牛。將以上兩種情況分為A和B兩組。

1.2.2 綿羊紅細(xì)胞懸液(SRBC)的制備 常規(guī)方法對綿羊頸靜脈采血,10 g/L肝素鈉抗凝,分離紅細(xì)胞,用D-Hanks液洗3次。配成終濃度為1×108個/mL的紅細(xì)胞懸液備用。

1.2.3 人外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備 靜脈采集人血液,10 g/L肝素鈉抗凝,加入等體積D-Hanks平衡鹽溶液,混勻,按每管2 mL～3 mL輕輕疊加于盛有等量人淋巴細(xì)胞分離液的10 mL離心管中。3 000 r/min離心30 min。離心結(jié)束后,吸取分離液與血漿交界部位的灰白層,用5倍體積的D-Hanks液以2 000 r/min離心10 min～15 min,洗滌3次,取l滴細(xì)胞懸液。用臺盼蘭拒染法鏡檢計數(shù)細(xì)胞,計算細(xì)胞活率?；盥试?5%以上則用含200 mL/L犢牛血清的D-Hanks液將細(xì)胞調(diào)整到4×108個/mL,備用。

1.2.4 抗淋巴細(xì)胞血清(ALS)制備 用Ficoll梯度分離牛淋巴細(xì)胞,以PBS清洗并稀釋后給兔進(jìn)行為期7周的耳靜脈免疫注射,于最后一次注射后第10天放血,分離血清,滅活、分裝后置于-30℃保存。

1.2.5 補(bǔ)體(GPC)準(zhǔn)備 選取2只雄性豚鼠,心臟穿刺采血并收集血清,將血清與牛和綿羊紅細(xì)胞等量混合,4℃下吸收2 h后離心去掉紅細(xì)胞,分裝血清,-100℃保存。

1.2.6 用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)(RIT)檢測孕牛血清中EPF活性 孕牛血清中EPF活性的檢測,采用Morton的玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn),并加以改進(jìn)。將來自外周血液、經(jīng)洗滌和稀釋的牛淋巴細(xì)胞在樣品血清中于 37℃孵育 30 min,再洗滌、稀釋后,放入含GPC的ALS中孵育90 min,然后加入SRBC,經(jīng)離心、固定、染色后觀察玫瑰花環(huán)形成情況。計數(shù)1 000個淋巴細(xì)胞的玫瑰花環(huán)數(shù)量,按ALS的最高稀釋倍數(shù)計算RIT,將結(jié)果與2個不加ALS的對照管的平均數(shù)進(jìn)行比較。ALS的稀釋倍數(shù)用其log2的倒數(shù)來表示。

RIT=Log2(10-3/ALS最高稀釋倍數(shù)),當(dāng)RIT≥4時,認(rèn)為是EPF陽性。

每次試驗(yàn)均設(shè)陽性及陰性對照。凡是對照血清與預(yù)期的變化不符,結(jié)果將不予采用。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,P＜0.05數(shù)據(jù)間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 陽性對照血清RIT值范圍

13份妊娠 4個～5個月孕牛血清,RIT值是6.39±0.87,范圍為5～7。

2.2 陰性對照血清RIT值范圍

16份陰性對照血清,RIT值是3.67±0.43,范圍為3～4,構(gòu)成非妊娠范圍。當(dāng)RIT值大于4,則表明樣本內(nèi)存在EPF活性。

2.3 待測人工授精孕牛血清

17頭人工受精的孕牛排卵后2 d～7 d血清中EPF活性測定及隨訪結(jié)果見表1。從表1可知,17頭人工授精的孕牛血液中13頭經(jīng)玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測出EPF活性,4頭孕牛血清中經(jīng)玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)未檢測出EPF活性。隨訪發(fā)現(xiàn)8頭孕牛娩出胎兒,2頭孕牛流產(chǎn),4頭未妊娠。在A組試驗(yàn)中,第1頭～9頭牛經(jīng)RIT檢測出EPF活性,但隨訪未妊娠推測可能是胚泡丟失所致;第10頭～12頭牛血清中未檢測出EPF活性。在B組試驗(yàn)中,第13頭～16頭牛血清經(jīng)RIT檢測出EPF活性,但隨訪未妊娠推測是胚泡丟失所致;第17頭牛血清中未檢測出EPF活性。結(jié)果表明,此17頭人工授精牛受精率為76.47%(13/17),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P＞0.05,A和B兩組受精率的差別無顯著性,見表2。而且妊娠率為58.82%(10/17),其中妊娠至分娩的成功率為 47.06%(8/17),妊娠早期流產(chǎn)率為11.76%(2/17),測出EPF活性隨訪未妊娠的植入期胚泡丟失率為23.08%(3/13)。EPF陽性和EPF陰性率的分布狀況如表3,胎兒產(chǎn)出率和胚胎消失率如表4。同時,發(fā)現(xiàn)EPF陰性牛均未妊娠。從表1中看出,對17頭人工授精的孕牛排卵后2 d～7 d血清中EPF活性測定發(fā)現(xiàn),13頭人工授精的孕牛血清中EPF呈陽性(+),并且 RIT＞4,表明13頭人工授精的孕牛血清中有EPF活性;4頭人工授精的孕牛血清中EPF呈陰性(-),并且 RIT＜4,表明4頭人工授精的孕牛血清中沒有EPF活性;對17頭人工授精的孕牛隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn),8頭孕牛娩出胎兒,2頭孕牛流產(chǎn),3頭孕牛胚泡丟失,4頭孕牛未妊娠。

EPF活性由分裂中的胚胎產(chǎn)生,當(dāng)卵子受精48 h后,可在母體血中檢測出。試驗(yàn)表明,卵子受精48 h～7 d內(nèi),血清中存在EPF活性(表 1),若胚泡植入障礙或胚胎流產(chǎn),則曾經(jīng)出現(xiàn)的EPF活性隨之消失。通過EPF活性的檢測,可在胚泡植入前確定人工授精者受精發(fā)生,及早防治內(nèi)分泌失調(diào)等因素引起的植入前胚泡丟失,進(jìn)一步確定妊娠早期胚胎狀況。

由表2可以看出,對17頭人工授精的孕牛排卵后2 d～7 d血清中EPF檢測發(fā)現(xiàn),13頭牛EPF活性檢測為陽性,有活性,表明能夠妊娠;4頭牛EPF活性檢測為陰性,無活性,表明未妊娠。統(tǒng)計學(xué)分析表明,且P＞0.05,A和B兩組受精率的差別無顯著性(P＞0.05)。

表1 17頭孕牛血清中EPF活性測定及隨訪結(jié)果Table 1 T he results of seral EPF bioactivity detection and following-up visity in 17 cows

表2 17頭孕牛排卵后2 d～7 d血液中EPF檢測結(jié)果Table 2 The results of seral EPF detection 2-7 d after ovulation in 17 cows

表3 EPF陽性率和EPF陰性率的分布狀況Table 3 The distribution of EPF-positive rate and EPF-negative rate

由圖3可知,通過RIT結(jié)果顯示,EPF陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于EPF陰性率。

表4 胎兒產(chǎn)出率和胚胎消失率Table 4 Fetal birth rate and embryo loss rate

由表4可知,17頭妊娠牛胎兒產(chǎn)出率接近50%,胚胎消失率接近18.5%,胎兒產(chǎn)出率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胚胎消失率。

3 討論

目前有關(guān)EPF的研究十分活躍,普遍認(rèn)為EPF與受精卵的出現(xiàn)和胚胎成活密切相關(guān)。當(dāng)精子穿透卵子形成受精卵后,受精卵開始分泌早孕因子釋放因子,卵巢在該因子的作用下分泌早孕因子,早孕因子的分泌與胚胎在母體子宮內(nèi)免受機(jī)體免疫系統(tǒng)的排斥有關(guān)。早孕因子釋放因子的分泌及分泌量代表了胚胎的形成及在子宮內(nèi)的生長狀態(tài),而早孕因子的分泌受早孕因子釋放因子正反饋調(diào)節(jié),其分泌量與早孕因子釋放因子的分泌量呈正相關(guān)[8-10]。因此,用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)對人工授精的孕牛血清EPF生物活性的檢測,可以對胚胎的形成及生長狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測[11-13]。本試驗(yàn)采用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)對17頭人工授精的母牛血清EPF生物活性進(jìn)行檢測,并非所有經(jīng)過人工授精的孕牛,其受精卵都能發(fā)育至正常妊娠。有些胚胎在很早期就消失而未引起注意,另外一些死亡較晚歸于早期流產(chǎn)[14-15]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8頭孕牛娩出胎兒,2頭孕牛流產(chǎn),4頭未妊娠,3頭胚泡丟失;13頭有EPF活性,4頭無EPF活性。EPF的活性由分裂中的胚胎產(chǎn)生,當(dāng)卵子受精48 h后,可在母體血液中檢測出。我們的研究也證實(shí),卵子受精48 h～7 d內(nèi),血液中存在EPF活性,若胚泡植入障礙,則曾經(jīng)出現(xiàn)的 EPF活性隨之消失。經(jīng)人工授精后,A組的第8、9號牛和B組的第16號牛,在排卵后2 d～7 d內(nèi),其血液中出現(xiàn)EPF活性,而受精7 d以后因胚泡植入障礙,排卵受精7 d前血液中曾出現(xiàn)的EPF活性隨之消失。從另一個角度說明了,受精7 d以后胚泡未植入子宮內(nèi)膜。本試驗(yàn)研究顯示,胚泡丟失率17.65%,胚泡丟失的原因可能與受精卵發(fā)育異常,子宮內(nèi)膜病變,內(nèi)分泌失調(diào)及免疫因子有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果為牛的早期妊娠診斷及今后進(jìn)一步研究奶牛妊娠調(diào)控提供了依據(jù)。

總之,EPF活性檢測,可在胚泡植入前確定人工授精后胚泡發(fā)育狀況,及早防治內(nèi)分泌失調(diào)等因素引起的植入前胚泡丟失,有利于建立對胚胎的形成及生長狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測,同時檢測血清中EPF為監(jiān)測胚胎發(fā)育提供了一種新方法。因此,用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)對人工授精的孕牛血液EPF生物活性的研究,對建立早期妊娠診斷方法和檢測早期胚胎發(fā)育情況以及確定早期胚胎死亡的方法具有重要意義。

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Detection of Biological Activity of EPF from Sera of Pregnant Cows and Analysis of the Pregnant Rate

ZHANG Hong-gang,CHEN Shu-lin,WANG Xiao-shan,ZHANG Wen-hua,MENG Xia,TANG Cai-yan

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

T he 17 seral samples of pregnant cows were detected for biological activity of early pregnancy factor by rosette inhibition test,and followed with returning visit investigation.The results showed that 13 samples were positive for EPF activity and 4 samples without EPF activity within 2 d-7 d after ovulation.The returning visit results showed that 18 pregnant cows gave birth to fetus,2 pregnant cows aborted,4 cows were non-pregnant.And artificial insemination rate was 76.47%,pregnanct rate was 58.82%,the success of pregnany to delivery was 47.06%,early pregnant abortion rate was 11.76%,embryo loss rate of 23.08%.The study of biological activity of seral EPF of pregnant cows with rosette inhibition test has significant reference value for early pregnant diagnosis,for early embryo growth detection and early embryonic death determination.

rosette inhibition test;early pregnancy factor;biological activity;detection;pregnancy

Q954.52

A

1007-5038(2010)08-0030-04

2010-06-08

國家自然科學(xué)基金(30972151);陜西省“13115”重大科技專項(2008ZDKG-05)

張宏剛(1982-),男,陜西扶風(fēng)人,碩士研究生,主要從事細(xì)胞工程研究。*通訊作者