趙程程,范東燕,葉海青

(1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,吉林長春 130021;3.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部食品質(zhì)量與安全系,吉林長春 130062)

大鼠胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及體外誘導(dǎo)成脂和成骨研究

趙程程1,范東燕2,葉海青3*

(1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,吉林長春 130021;3.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部食品質(zhì)量與安全系,吉林長春 130062)

從新生大鼠胰腺中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),研究其分化潛能,為胰腺疾病的干細(xì)胞移植治療探尋新的細(xì)胞來源。無菌條件取出新生3 d的大鼠胰腺,通過Ⅴ型膠原酶消化獲得細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)傳代、貼壁篩選法純化細(xì)胞、吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞儀測定表面標(biāo)志CD34和CD44;用成骨、成脂誘導(dǎo)劑鑒定其分化潛能。結(jié)果顯示,純化細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)劑作用下被誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞,在成脂誘導(dǎo)劑作用下被誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞。證明所純化的細(xì)胞為尚未分化的基質(zhì)細(xì)胞,而不是組織的成體細(xì)胞,它具有多向分化潛能。

大鼠;胰腺;間充質(zhì)干細(xì)胞;分化潛能;誘導(dǎo)

干細(xì)胞(stem cell,SC)是指具有自我更新能力與多向分化潛能的幼稚細(xì)胞,能在適當(dāng)微環(huán)境下形成多種組織和器官[1]。在個(gè)體發(fā)育過程中,胚胎干細(xì)胞[2]能夠分化成機(jī)體各種類型的多能干細(xì)胞,以及各種組織中的定向干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。近年報(bào)道從早產(chǎn)胎兒臍帶血[3]、臍帶靜脈內(nèi)皮下層[4]、肝臟、皮膚、骨膜、肌腱、脂肪組織等均分離到MSCs。MSCs還具有明顯的可塑性,而且易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增,易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá),遺傳背景相當(dāng)穩(wěn)定[5]。由于MSCs的這些特性,使得其在組織工程創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞替代治療、支持造血、基因治療等方面的應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。從大鼠胰腺分離MSCs國內(nèi)外鮮有報(bào)道,尚未見大鼠胰腺M(fèi)SCs誘導(dǎo)分化的研究報(bào)道。本文從新生大鼠胰腺分離純化間充質(zhì)干細(xì)胞,通過應(yīng)用成骨和成脂誘導(dǎo)劑對其進(jìn)行誘導(dǎo),觀察其對誘導(dǎo)劑的反應(yīng),進(jìn)一步對其細(xì)胞來源進(jìn)行鑒定,并對其分化特性進(jìn)行研究,為胰腺疾病的干細(xì)胞移植治療探尋新的細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 d齡內(nèi)的新生Wistar大鼠10只,吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清,β-磷酸甘油鈉(β-GP),Ⅴ型膠原酶(Sigma),ALP試劑盒(博士德公司),胰島素(丹麥公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胰腺M(fèi)SCs的分離、擴(kuò)增及鑒定 將新生大鼠脫臼處死,750 mL/L酒精浸泡消毒3 min,無菌取出胰腺,去除網(wǎng)膜,脂肪,經(jīng)4 ℃Hank's液漂洗2次～3次,用眼科剪剪成組織碎片,Hank's液漂洗3次后加5倍體積Ⅴ型膠原酶(pH 7.4)混勻,37℃水浴震蕩8 min～10 min,至消化液渾濁時(shí)自然沉淀吸取上層消化液,迅速用4℃冷 Hank's液終止消化。剩余未消化組織補(bǔ)加消化液繼續(xù)消化,重復(fù)4次～5次。收集消化液1 000 r/min離心5 min,沉淀細(xì)胞以1×106mL接種于含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基,37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)18 h后,用彎頭吸管輕輕吹打瓶壁,棄去懸浮細(xì)胞和半貼壁細(xì)胞(實(shí)質(zhì)細(xì)胞),將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3 d換半液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),2.5 g/L胰酶消化,常規(guī)傳代,取第3代培養(yǎng)細(xì)胞爬片,用吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)。用美國B-D公司生產(chǎn)的FACScan流式細(xì)胞儀直接熒光法,通過檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD44鑒定胰腺M(fèi)SC。其中激發(fā)光源為15 mW 氬離子激光,波長488 nm。FACS軟件收集細(xì)胞,Lysis軟件分析處理數(shù)據(jù),記錄陽性細(xì)胞百分率。

1.2.2 成骨誘導(dǎo)

1.2.2.1 誘導(dǎo)方法 將融合生長的第3代細(xì)胞消化記數(shù),以相同種植密度5×103/mL種于24孔板中,常規(guī)培養(yǎng)和在培養(yǎng)液中分別加入成骨誘導(dǎo)劑-地塞米松、β-甘油磷酸鈉和 L-抗壞血酸(10-7mol/L、10 mmol/L 、50 μ g/mL)培養(yǎng) 。

1.2.2.2 成骨特性鑒定 鈣鈷法ALP組織化學(xué)染色將誘導(dǎo)10 d、20 d后鋪滿細(xì)胞的蓋玻片取出,PBS沖洗,950 mL/L 酒精固定,孵育液(20 g/L β-甘油磷酸鈉、20 g/L巴比妥納、20 g/L氯化鈣和20 g/L硫酸鎂)pH 7.2,在37℃條件下孵育1 h～3 h,蒸餾水洗1次,20 g/L硝酸鈷水溶液作用2 min,蒸餾水洗1 min,10 g/L硫化銨水溶液作用1 min,流水洗后中性紅復(fù)染核。

1.2.3 成脂肪誘導(dǎo)

1.2.3.1 誘導(dǎo)方法 將融合生長的第6代MSCS消化計(jì)數(shù),以相同種植密度5×103/mL接種于24孔板中,分別進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和在培養(yǎng)液中加入成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)。細(xì)胞接種在正常培養(yǎng)體系中3 d～7 d,細(xì)胞接近融合后加入包括1 μ mol/L的地塞米松 、10 μ g/mL胰島素和 50 mL/L FBS 的培養(yǎng)基 ,繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h,可重復(fù)以上步驟至出現(xiàn)脂滴。

1.2.3.2 脂肪細(xì)胞特異性染色——油紅染色100 mL/L甲醛等滲鹽溶液將細(xì)胞固定10 min,油紅染色3 min～5 min,600 g/L磷酸三乙酯洗15 s～30 s,蒸餾水沖洗15 s～30 s,蘇木素復(fù)染核1 min,自來水洗5 min,甘油明膠液封片。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的分離、擴(kuò)增、培養(yǎng)與鑒定

種植2 h后細(xì)胞開始貼壁,24 h內(nèi)大部分細(xì)胞貼壁,少部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液,成團(tuán)聚集(為實(shí)質(zhì)細(xì)胞)。倒置顯微鏡下,貼壁細(xì)胞呈圓形,有小的胞漿突起。72 h后,大多數(shù)細(xì)胞有胞漿突起,呈圓形、橢圓形、星形或梭形。1周后以梭形細(xì)胞為主,胞漿豐富,核大,核染色質(zhì)細(xì),核仁明顯(圖1A)。隨傳代次數(shù)增加,懸浮細(xì)胞逐漸減少,貼壁細(xì)胞形態(tài)上逐漸趨于一致。第3、5代細(xì)胞吉姆薩染色后,光鏡下可見成纖維樣細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞成平行排列生長或旋渦狀生長(圖 1B)。流式細(xì)胞儀檢測胰腺M(fèi)SCs的CD34、CD44的表達(dá)陰性(圖2)。

圖1 胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Culture and iclentification of pancreas MSCS

圖2 CD34和CD44在胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)Fig.2 Expression of CD34 and CD44 in pancreas MSCs

2.2 成骨誘導(dǎo)

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 多次傳代的MSCs達(dá)融合生長時(shí),有更均勻有序的成纖維樣細(xì)胞分布(圖3A)。成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,出現(xiàn)扁平無規(guī)則細(xì)胞堆積,光學(xué)顯微鏡下觀察可見有明顯的鈣化結(jié)節(jié)(圖3B)。這時(shí)的細(xì)胞排列有一定的方向性,呈漩渦樣生長,渦旋中心細(xì)胞呈多層分布,細(xì)胞界限不清,細(xì)胞形態(tài)呈多角形或圓形。

2.2.2 鈣鈷法ALP組織化學(xué)染色 未誘導(dǎo)細(xì)胞鈣鈷法ALP組織化學(xué)染色為陰性(圖3C),誘導(dǎo)細(xì)胞鈣鈷法ALP組織化學(xué)染色在第10天時(shí)不明顯,在第20天時(shí)可見陽性細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)灰黑色顆粒沉淀,深淺不一,細(xì)胞密集區(qū)染色較深(圖3D)。

圖3 胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)Fig.3 Pancreas MSCs were induced into bone formation cells

2.3 成脂誘導(dǎo)

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 在成脂誘導(dǎo)劑中培養(yǎng)的細(xì)胞,逐漸變圓,體積較大,細(xì)胞膜較薄,膜輪廓不光滑,凹凸不平有皺褶,3 d左右在一些細(xì)胞核周圍出現(xiàn)折光性強(qiáng)的脂肪小滴,逐漸增多并融合成大脂肪滴,隨著時(shí)間延長,脂滴逐漸增加并融合為脂泡。細(xì)胞由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或多角形,7 d左右可見折光性強(qiáng)的脂肪小滴及融合的大脂肪滴出現(xiàn),大量圓形脂滴,大小不等且多散在,核仍位于邊緣,而對照組的MSCs始終為長梭形,無脂滴積聚。

2.3.2 脂肪細(xì)胞特異性染色結(jié)果 染色后脂滴為橙紅色(圖4A),脂肪細(xì)胞中含有大小不等的脂肪滴,細(xì)胞核被脂滴擠于一側(cè),給蘇木素復(fù)染,胞核為藍(lán)色(圖4B)。

圖4胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)Fig.4 Pancreas MSCs were induced into fat cells

3 討論

3.1 胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

大量研究表明,任何器官與組織基質(zhì)細(xì)胞均是某一器官、組織功能細(xì)胞的支持細(xì)胞。所以,各器官與組織內(nèi)均存在具有干細(xì)胞特點(diǎn)的間質(zhì)細(xì)胞系[6]。胰腺組織屬于體內(nèi)較穩(wěn)定組織,呼瑩等[7]證明胎兒胰腺中存在MSCs。Rapoport D H等[8]從人胰腺分離出細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)獲得多能干細(xì)胞。本文利用常規(guī)貼壁篩選純化法成功獲得了胰腺M(fèi)SCs。培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞倍增時(shí)間平均為5 d,說明其有較強(qiáng)的增殖能力,通過測定表面抗原CD34、CD44均表達(dá)陰性,干細(xì)胞表面抗原CD34、CD44為陰性表達(dá)[9],證明其具有干細(xì)胞特性。

3.2 誘導(dǎo)成骨、成脂分化特性

胰腺M(fèi)SCs是多能干細(xì)胞,具有多向分化潛能,在體外培養(yǎng)條件下,加入相應(yīng)的誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)成骨或成脂等。

體外培養(yǎng)時(shí)成骨分化很大程度上依賴于誘導(dǎo)條件,其中基本的輔劑為地塞米松(Dex)、β-甘油磷酸鈉(β-GP)和維生素C[10]。Dex可誘導(dǎo)MSCs分化表達(dá)OCN,增加OP和 ColI mRNA,提高M(jìn)SCs對甲狀旁腺激素(PTH)和前列腺素 E2(PGE2)反應(yīng)的cAMP水平;同時(shí)還可以調(diào)節(jié)成骨樣細(xì)胞合成胰島素樣生長因子(IGFs)和促進(jìn)膠原合成的作用,刺激其ALP活性。Chung C H等[11]認(rèn)為,體外成骨細(xì)胞骨化必須有β-甘油磷酸鈉的參與,β-GP提供磷離子作為ALP作用的底物,誘導(dǎo)和激活A(yù)LP,促進(jìn)有機(jī)磷向無機(jī)磷轉(zhuǎn)化,并加速鈣鹽沉著才能形成鈣沉積。但其在懸液中的濃度不能超過2 mmol/L,否則,不能形成鈣沉積。維生素C可通過多種途徑如基因轉(zhuǎn)錄、羥基化以及前膠原形成等刺激細(xì)胞外膠原基質(zhì)的生物合成,含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)合成是誘導(dǎo)成骨的必須要求。研究證實(shí)[12]維生素C可誘導(dǎo)BMSCs的ALP活性,促進(jìn)成骨標(biāo)記蛋白mRNA的表達(dá),鈣的沉積,礦化結(jié)節(jié)的形成。ALP是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶之一[13],它能夠水解堿性磷酸酶,使局部PO4+濃度升高,破壞鈣化抑制劑,在體外鈣化起著關(guān)鍵作用,因而也用于證明所誘導(dǎo)的細(xì)胞具有與成骨細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。

骨形成過程的起始還與骨量的多少、MSCs的接種數(shù)量以及密度有關(guān)[14]。Nuttall M E等[15]報(bào)道,已表達(dá)骨鈣素OCN的成骨細(xì)胞能被100%誘導(dǎo)表達(dá)成脂肪細(xì)胞;肥大的軟骨細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化而表達(dá)成骨細(xì)胞的標(biāo)志物。所以,人們推測在MSCs分化的過程中存在雙潛能細(xì)胞的階段。

本文用地塞米松,胰島素等試劑誘導(dǎo)3 d時(shí)MSCs有脂滴出現(xiàn),隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長,細(xì)胞中的脂肪滴逐漸增加,并融合成較大的脂肪泡。脂肪細(xì)胞分化過程可分為多能干細(xì)胞-脂肪母細(xì)胞-前脂肪細(xì)胞-不成熟脂肪細(xì)胞-成熟脂肪細(xì)胞。一般認(rèn)為,前脂肪細(xì)胞經(jīng)歷不成熟脂肪細(xì)胞階段后分化為成熟脂肪細(xì)胞,而不成熟脂肪細(xì)胞的特征是細(xì)胞內(nèi)含較多小脂滴[16]。從脂滴出現(xiàn)到整個(gè)細(xì)胞內(nèi)脂滴融合,這一階段相當(dāng)于不成熟脂肪細(xì)胞階段[17],但在鏡下出現(xiàn)明顯脂滴之前,已分化的細(xì)胞內(nèi)透亮顆粒,從胞膜下開始出現(xiàn),沿細(xì)胞膜呈周圍性分布,此階段應(yīng)為不成熟脂肪細(xì)胞的初期階段。待均勻脂滴充滿細(xì)胞后又經(jīng)歷一次更大體積的脂滴融合,成為細(xì)胞內(nèi)的脂泡。在此階段細(xì)胞形態(tài)變化較大,以后即進(jìn)入終末分化階段。Patricia A等[18]研究表明,在脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控中,核激素受體家族中PPARγ 2、轉(zhuǎn)錄因子家族成員C/EBP以及脂肪決定-分化因子1起決定作用。骨髓基質(zhì)細(xì)胞斑點(diǎn)印跡分子雜交研究表明,地塞米松能夠誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。Ap2 mRNA是脂肪細(xì)胞分化晚期特異性標(biāo)志物,僅在脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)。成脂誘導(dǎo)使Ap2 mRNA表達(dá)明顯高于對照組,表明激素能夠從基因水平直接誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化;糖皮質(zhì)激素可以通過Ap2基因5′旁側(cè)區(qū)中的成分介導(dǎo)激活A(yù)p2基因轉(zhuǎn)錄,這可能是地塞米松誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的分子機(jī)制。

本文從新生大鼠胰腺中分離純化出間充質(zhì)干細(xì)胞,并在體外采用不同的誘導(dǎo)劑將純化細(xì)胞誘導(dǎo)成骨、成脂,說明胰腺中存在尚未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞,它具有多向分化潛能,這將為胰腺相關(guān)疾病的干細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源提供新的思路。

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Study on Separation,Identification and Differentiation Potential of Rat Pancreas Mesenchymal Stem Cells

ZHAO Cheng-cheng1,FAN Dong-yan2,YE Hai-qing3

(1.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,J ilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China;2.Department of Health Toxicology,School of Public Health,Jilin University,Changchun,J ilin,130021,China;3.Department of Food Quality and Saf ety,School of Agriculture,J ilin University,Changchun,J ilin,130062,China)

To study the differentiation potential of MSCs that isolated from neonate rat's pancreas,and find a new source of cells for treatment of pancreas disease by stem cell transplantation,pancreases were taken out of three-day-old Wistar rats under bioclean condition,and cells were obtained by V-collagenase digestion.Generations were passed by conventional culture,cells were purified by adherence screening method,cell morphous was observed by Giemsa staining.The expressions of surface marker CD34 and CD44 were determined by FCM.The differentiation potential were evaluated by induction with ossification inducer and fat inducer.Purified MSCs were induced into bone cells by ossification inducer and were induced into fat cells by fat inducer,and it proved that purified cells are not adult somatic cells but matrix cells,and it has multi-differentiation potential.

rat;pancreas;mesenchymal stem cells;differentiation potential;induction

2010-01-20

資金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(39970741)

趙程程(1988-),女,吉林長春人,主要從事生物工程研究。*通訊作者

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0011-06