李大海， 申秀英，2, 章子貴

(1.浙江師范大學(xué) 生態(tài)研究所,浙江 金華 321004;2.浙江科技學(xué)院 生物工程系,浙江 杭州 310023)

慢性氟中毒是以損害牙齒和骨骼的硬組織為主的全身中毒性疾病，而非骨相損害可累及多種組織和器官.氟能夠引起紅細(xì)胞明顯變形，并能引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)損傷和膜蛋白組分發(fā)生改變，產(chǎn)生毒害作用，所以紅細(xì)胞可能是氟攻擊的靶目標(biāo)之一[1-3].細(xì)胞膜的流動(dòng)性是細(xì)胞功能的重要參數(shù)，影響完整的膜蛋白定向、膜滲透性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程等，而細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平的提高能夠影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性[4].張本忠[5]對(duì)30 d齡大鼠經(jīng)腹腔注射染氟50 d后，用熒光偏振法發(fā)現(xiàn)氟能夠引起生物膜流動(dòng)性下降.氟主要經(jīng)過(guò)消化道進(jìn)入人體，再加上人體接觸外源性化學(xué)物質(zhì)往往是較低劑量的長(zhǎng)期接觸，所以筆者在3月亞慢性染毒的基礎(chǔ)上，采用飲水中加氟的方式進(jìn)行染毒期分別為9月和18月的慢性染毒，通過(guò)電子自旋共振(ESR)法檢測(cè)紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，同時(shí)測(cè)定血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)活性，為氟中毒機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，選用SD品系初斷乳的雄性大鼠，體質(zhì)量為(65±9.8) g.隨機(jī)將大鼠分成4組，分別是對(duì)照組、低氟組、中氟組和高氟組，每組16只，其中對(duì)照組飲用自來(lái)水，其他3組飲水中分別加氟15,30,60 mg/L.每天喂食由金華市藥品檢驗(yàn)所提供的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠配合飼料.飼養(yǎng)室采用空調(diào)和自動(dòng)排風(fēng)裝置保持通風(fēng)，室溫15～25 ℃，濕度40%～70%；以刨花為墊料，每2 d更換一次.飼養(yǎng)期為9,18月.

1.2 主要試劑和儀器

氟化鈉(NaF)固體(武漢華創(chuàng)化工有限公司)；MDA，SOD，GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)；16-DOXYL標(biāo)記物(美國(guó)Sigma公司).臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendor F公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo電子公司);電子自旋共振波譜儀(德國(guó)Brucker公司).

1.3 血氟的測(cè)定

大鼠飼養(yǎng)到第3月結(jié)束時(shí)尾部取血，采用氟離子電極法測(cè)定血氟濃度.

1.4 紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定

各組大鼠飼養(yǎng)9月后立即處死8只,18月后處死剩余的8只.大鼠斷頭取血后加入肝素鈉(50 U/mL)抗凝，離心(3 000 r/min，10 min)，除去血漿、白細(xì)胞和血小板.用預(yù)冷生理鹽水洗滌3次，收集紅細(xì)胞，加40倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，在低滲情況下溶血3 min破膜，離心(12 000 r/min，10 min)，棄去上清液，再用上述緩沖液洗滌3次，可得到乳白色的紅細(xì)胞膜.將所得紅細(xì)胞膜懸浮在2～4 mL pH 7.4等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定膜蛋白含量，使膜蛋白含量為0.5～1.0 mg/mL.取30 μL紅細(xì)胞膜懸浮液于樣品管中，加入0.2 mmol/L的16-DOXYL，在37 ℃下溫育1 h，以等滲PBS清洗3次，每次5 min，至上清液中無(wú)ESR信號(hào)檢出，除去上清液，將紅細(xì)胞膜吸入毛細(xì)石英管中室溫下檢測(cè).檢測(cè)條件：微波功率10 mW，調(diào)制100 kHz，調(diào)制幅度2 G，掃寬100 G，時(shí)間常數(shù)0.64 s，溫度24 ℃.參照文獻(xiàn)[6]，所得圖譜如圖1所示,按照公式

計(jì)算旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間.

圖1 16-DOXYL標(biāo)記的紅細(xì)胞膜ESR波譜

1.5 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

血清超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用羥胺比色法，過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)活性的測(cè)定采用比色法，均按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作.

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 血液內(nèi)氟含量的測(cè)定

從表1可以看出，隨著給氟量的升高，血氟含量上升，且差異顯著(P<0.05)，表明氟中毒模型復(fù)制成功.

表1 血氟含量的測(cè)定結(jié)果

2.2 慢性氟中毒對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

膜流動(dòng)性與旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間成反比，旋轉(zhuǎn)時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明膜流動(dòng)性越低，反之亦然.從表2可以看出，與對(duì)照組相比，2個(gè)染毒期內(nèi)染氟組紅細(xì)胞膜流動(dòng)性都有所下降，其中染毒期為9月時(shí)中氟組和高氟組呈顯著性下降(P<0.05)，而且中氟組下降幅度最大；而染毒期為18月時(shí)各染氟組紅細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著性降低(P<0.05)，其中高氟組下降幅度最大.與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月的各組都有一定程度的下降，其中對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而染氟組有顯著性差異(P<0.05).

表2 旋轉(zhuǎn)時(shí)間的測(cè)定結(jié)果

2.3 慢性氟中毒對(duì)血液抗氧化能力的影響

從表3可以看出:與對(duì)照組相比，染毒期為9月的中氟組MDA含量顯著上升(P<0.05)，低氟組和高氟組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);而染毒期為18月的高氟組MDA含量顯著上升(P<0.05)，低氟組和中氟組無(wú)顯著性差異(P>0.05).與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月的各組MDA含量都有一定程度的上升，其中高氟組顯著性升高(P<0.05)，其他3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

表3 MDA含量的測(cè)定結(jié)果

從表4可以看出:與對(duì)照組相比，2個(gè)染毒期中各染氟組SOD活性降低，其中染毒期為9月的中氟組呈現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)，低氟組和高氟組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；染毒期為18月時(shí)，染氟組的SOD活性顯著性下降(P<0.05).與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月各組的SOD活性都有一定程度的下降，其中高氟組顯著性下降(P<0.05)，其他3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

表4 SOD活性的測(cè)定結(jié)果

從表5可以看出:與對(duì)照組相比，2個(gè)染毒期中各染氟組大鼠血清中GSH-Px活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而且下降幅度較大，都呈顯著性下降(P<0.05).與染毒期為9月的同組相比，染毒期為18月各組的GSH-Px活性都有所下降，其中高氟組顯著性下降(P<0.05)，其他3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

表5 GSH-Px活力的測(cè)定結(jié)果

3 討 論

氟是一種原生質(zhì)毒物，生物膜是氟毒性作用的靶子之一，以多種生物膜為材料的生化毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，氟與生物膜之間的相互作用可以改變膜結(jié)合蛋白的活性和膜脂[7-9].曹言濤等[10]發(fā)現(xiàn)，氟能夠抑制牛脾淋巴細(xì)胞膜ATP酶活性，從而影響細(xì)胞膜的功能.章子貴等[11]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期攝入高氟導(dǎo)致紅細(xì)胞膜磷脂含量降低，飽和脂肪酸比例升高，不飽和脂肪酸比例降低，而且多不飽和酸變化比較明顯，表明膜流動(dòng)性可能發(fā)生變化，出現(xiàn)老化現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，染氟組大鼠紅細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，9月染氟期中氟組和高氟組明顯降低，而18月時(shí)所有染氟組都明顯地降低.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：慢性氟中毒使紅細(xì)胞膜生物理化性質(zhì)發(fā)生明顯的變化，導(dǎo)致紅細(xì)胞形態(tài)改變和功能下降，這對(duì)地方性氟中毒病的發(fā)生、發(fā)展可能起一定的作用.

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可發(fā)現(xiàn)，與9月染氟期相比，18月染氟期的紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和抗氧化能力在同組中都呈現(xiàn)不同程度的下降，說(shuō)明隨著染氟期的加長(zhǎng)，氟對(duì)機(jī)體的損傷作用逐漸積累并加強(qiáng).值得注意的是，在染氟期為9月時(shí)中氟組對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性及抗氧化能力的有害影響高于高氟組，而染氟期為18月時(shí)高氟組的紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和抗氧化能力損傷最嚴(yán)重，這可能與過(guò)高劑量的氟在引起機(jī)體損傷的同時(shí)也能引起機(jī)體代償性的保護(hù)有關(guān)，而隨著染毒期的延長(zhǎng)，這種機(jī)體代償性保護(hù)性作用消失了.

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