張健平, 吳玉環(huán), 劉 鵬, 徐根娣, 唐秀梅, 鄭國紅

(1.浙江師范大學(xué) 植物學(xué)實驗室,浙江 金華 321004;2.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310000)

錳是植物生長所必需的微量元素，在植物的光合過程和氮代謝中起著極其重要的作用[1],它是許多重要酶的激活物，同時也是光合作用中水解酶的一個基本組分.但過量的錳會對植物產(chǎn)生毒害，并且是多元化的，在組織細(xì)胞水平上，根尖分生區(qū)是錳毒危害的主要部位[2].正常生長的植物錳含量一般在20～500 mg/kg，因植物種類而異，很少超過1 000 mg/kg.近年來,一些能夠在植物地上部分大量富集污染物的特殊植物——超積累植物(Hyperaccumulator)成為學(xué)術(shù)界研究的熱點[3].美洲商陸(Phytolaccaamericana)對錳有明顯的積累能力,葉片錳含量最高達(dá)19.299 g/kg[4].而小飛蓬(Comnyzacanadensis)為一年生草本植物，與美洲商陸同為雙子葉植物，根系形態(tài)相似，任立民等[5]對其與美洲商陸進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)小飛蓬耐錳性較差.

根系分泌物是植物在生長過程中通過根的不同部位向基質(zhì)(土壤、營養(yǎng)液等)中分泌的一組種類繁多的物質(zhì)，是植物與土壤、水、大氣進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換的載體，在提高根際微生態(tài)的養(yǎng)分有效性、改善超積累植物對重金屬污染的修復(fù)作用、分泌化感物質(zhì)，以及植物遺傳改良等方面具有重要作用[6].根系分泌物能幫助植物進(jìn)行修復(fù)的途徑是多種多樣的，在清除重金屬污染時主要分泌有機(jī)酸、氨基酸、糖、生長物質(zhì)等到根際環(huán)境，對植物根際的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性及各種養(yǎng)分、有益和有害物質(zhì)進(jìn)入植物體內(nèi)產(chǎn)生重要影響[7].

本實驗以錳超積累植物美洲商陸和非錳超積累植物小飛蓬為實驗材料，采用水培方式，通過測定2種植物在錳毒脅迫下的根長、根體積和根直徑，以及總糖、氨基酸和有機(jī)酸的含量，比較2種草本植物在錳毒脅迫下的根系形態(tài)及根系分泌物變化的異同，擬從植物根系出發(fā)闡明植物對錳毒的耐性機(jī)制和根系分泌物對錳毒的作用.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

美洲商陸與小飛蓬均采于浙江師范大學(xué)生物園.選取大小一致的美洲商陸種子，于濃硫酸中浸泡10 min，用清水將其洗凈，播種于裝有濕沙的鐵盤中，25 ℃條件下萌發(fā)[8].小飛蓬于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，再轉(zhuǎn)到濕沙中.待2種植物植株長到5～6 cm高時，用改良的Hoagland完全營養(yǎng)液于3 L黑漆漆過的有蓋塑料桶中預(yù)培養(yǎng)7 d，每桶8株，3次重復(fù).

1.2 實驗設(shè)計

錳源采用MnCl2·4H2O，所用試劑均為分析純.以正常Hoagland營養(yǎng)液作為對照(含Mn2+0.005 mmol/L)，其他錳處理濃度分別為1,5,10,15 mmol/L，用NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)pH，使pH值維持在4.5～5.5,置于恒溫培養(yǎng)箱中(20～24 ℃，濕度50%～75%)，每天12 h晝夜循環(huán)光照，每天定時通氣2 h, 每5 d更換營養(yǎng)液.

1.3 根系分泌物收集與測定

錳處理14 d后，上午08:30左右將美洲商陸與小飛蓬各8株從桶中取出，用去離子水洗凈，用吸水紙吸干水分后，將根放入盛有200 mL雙蒸水的塑料杯中收集根系分泌物,光照收集12 h后取出植物.收集的根系分泌物用RE52-98型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃)定容至10 mL，保存于-20 ℃冰箱中待用.總糖含量根據(jù)蒽酮比色法測定[9]，以mg·mL-1表示；總氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定[10]，以mg·mL-1表示；有機(jī)酸含量用NaOH滴定法測定[11]，以mol·g-1表示.根系分析采用根系分析儀(型號：STD 1600+)分析.

1.4 數(shù)據(jù)分析

每處理重復(fù)測定3次，根據(jù)3次實驗所得數(shù)據(jù)計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，利用SAS分析軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 錳對小飛蓬與美洲商陸根系形態(tài)的影響

由圖1所示，在錳處理第14天，小飛蓬的根長隨著錳濃度的升高而減小，當(dāng)錳處理濃度升高到5 mmol/L時其根長不再減小，維持在一定的范圍內(nèi)；根直徑則隨著錳處理濃度的升高呈先減小后增大再減小的趨勢，各處理組與對照相比均沒有顯著差異；根體積的變化趨勢與根長相一致.美洲商陸根長在錳處理濃度為1 mmol/L時與對照差異不顯著，5 mmol/L錳處理下根長急劇增加并達(dá)到最大值，隨著錳濃度的升高又大致呈減小的趨勢，但均高于對照;根直徑則隨著錳處理濃度的升高而逐漸減小;根體積隨著錳處理濃度的升高先增大后減小，在5 mmol/L錳處理時達(dá)到最大值.美洲商陸根長、根直徑、根體積在處理 14 d時變化幅度比小飛蓬的大，這可能與其耐錳機(jī)制有關(guān).

(a)根長

(b)根直徑

(c)根體積

2.2 錳對小飛蓬與美洲商陸根系分泌物中總糖含量的影響

圖2 錳對美洲商陸與小飛蓬根系總糖含量的影響

由圖2可知，2種植物根系分泌物中的總糖含量均隨著錳處理濃度的升高而呈先上升后下降的趨勢.小飛蓬和美洲商陸在錳濃度為5 mmol/L時，其總糖分泌量達(dá)到最大，與對照相比分別上升了56.25%和142.08%，有顯著差異(P<0.05);之后,隨著錳處理濃度的升高,其總糖含量有所下降.小飛蓬根系分泌物中總糖含量的變化較美洲商陸的變化緩和，在10和15 mmol/L 2個錳濃度間其總糖含量無顯著差異;而美洲商陸在5和10 mmol/L 2個錳濃度間總糖含量無顯著差異.

2.3 錳對小飛蓬與美洲商陸根系分泌物中氨基酸含量的影響

從圖3可知，美洲商陸根系分泌物中氨基酸含量在各錳處理濃度下均比小飛蓬根系分泌物中高，且隨著錳濃度的升高而呈先上升后下降的趨勢，在10 mmol/L錳處理時達(dá)到最大值，比對照上升了82.55%，而在15 mmol/L錳處理時降到最低，是對照的68.00%.對于小飛蓬，其氨基酸含量在1 mmol/L錳處理時與對照相比變化不大，當(dāng)錳處理濃度升高到5 mmol/L時氨基酸含量下降，達(dá)到顯著性差異水平(P<0.05)，之后則呈先上升后下降的趨勢.

圖3 錳對美洲商陸與小飛蓬根系氨基酸含量的影響

2.4 錳對小飛蓬與美洲商陸根系分泌物中有機(jī)酸含量的影響

圖4 錳對美洲商陸與小飛蓬根系有機(jī)酸分泌的影響

由圖4可知，小飛蓬與美洲商陸根系分泌的有機(jī)酸含量隨著錳濃度的上升而上升，且均在15 mmol/L錳處理下達(dá)到最大值，分別是對照的219.00%與215.30%.美洲商陸根系分泌的有機(jī)酸含量較同濃度錳處理的小飛蓬的有機(jī)酸含量高.對于小飛蓬，有機(jī)酸含量在1和5 mmol/L錳處理下顯著高于對照，在之后較高濃度的錳處理下變化緩和.而美洲商陸的有機(jī)酸含量在1 mmol/L錳處理下與對照差異不明顯，在5和10 mmol/L錳處理下明顯上升，與對照相比均達(dá)到顯著性差異水平(P<0.05).

3 討 論

以往對超積累植物美洲商陸的研究主要集中在植物對錳的富集作用及其營養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)的變化方面[12-13]，錳對美洲商陸根系生長發(fā)育的影響鮮見報道.本文從美洲商陸根系形態(tài)、根系分泌物對錳脅迫的響應(yīng)出發(fā)進(jìn)行研究，并與非耐錳植物小飛蓬作對照，為揭示超積累植物耐性機(jī)理提供參考.根長、根體積、根直徑是反映植物根系生長發(fā)育狀況的指標(biāo).本實驗結(jié)果表明：大于1 mmol/L錳處理能促進(jìn)美洲商陸根系生長，根長增加、根直徑減小，說明其作為一種錳超積累植物在濃度較高的錳處理下其根發(fā)展為較細(xì)的長根；而非錳超積累植物小飛蓬，隨著錳濃度的升高，其根系的生長受到抑制.對2個物種進(jìn)行雙因素方差分析，也表明超積累植物美洲商陸在重金屬脅迫下已經(jīng)建立了一套相應(yīng)的自我適應(yīng)機(jī)制,根系生長與常規(guī)植物相比產(chǎn)生了顯著變化.本實驗結(jié)果與前人研究鋅超積累植物[14-15]的結(jié)果一致.但在10和15 mmol/L錳處理下，美洲商陸的根長與根體積受到抑制，但仍高于對照，說明錳處理濃度大于10 mmol/L時會影響美洲商陸根系生長.文獻(xiàn)[16]對美洲商陸的研究也得到同樣的結(jié)果.

根系分泌物的組成與含量變化是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫最直接、最明顯的反應(yīng).根系分泌物中的總糖、氨基酸等是根際微生物的能源和碳源[17];有機(jī)酸可以促進(jìn)金屬的溶解和釋放,提高金屬的植物有效性.據(jù)研究，超積累植物向根際分泌的有機(jī)酸與其超積累特性有關(guān)，如Ni超積累植物Alyssumlesbiacum對Ni的超積累作用與組氨酸在根際對Ni 的螯合作用有關(guān)[18].本實驗中，錳超積累植物美洲商陸在錳處理下分泌的總糖與氨基酸的含量大于非耐錳植物小飛蓬，且隨著錳濃度的升高而逐漸升高，推測超積累植物可能通過改變根際微生物的組成和活性而改變根際環(huán)境中重金屬的數(shù)量和活度等，形成特殊的微生物區(qū)系以適應(yīng)高錳環(huán)境.但在15 mmol/L錳處理下,美洲商陸的總糖含量與氨基酸含量均有所下降，說明過高濃度的錳處理會抑制兩者的根系分泌.美洲商陸與小飛蓬根系分泌的有機(jī)酸含量隨著錳處理濃度的升高而升高，這可能是高濃度的錳使植物做出的應(yīng)激反應(yīng).這些有機(jī)酸含有羥基和羧基等功能基團(tuán),對溶液中富余的金屬離子特別是毒性重金屬離子有較強(qiáng)的絡(luò)合能力[19],同時能酸化根際環(huán)境,促進(jìn)重金屬的溶解和根系的吸收.推測超富集植物美洲商陸為了適應(yīng)高濃度的錳脅迫，根系分泌物中的有機(jī)酸在培養(yǎng)液中與錳形成了螯合物，從而增強(qiáng)了其對培養(yǎng)液中錳的吸收;而非超積累植物小飛蓬分泌有機(jī)酸量較少的原因,除了對錳脅迫耐性能力較差外，還有可能是在較高濃度的錳處理下根系生長受到抑制而導(dǎo)致分泌量減少.

根系分泌物是由植物根系不同部位分泌產(chǎn)生的，伸長區(qū)是根系分泌物釋放的主要部位[6]，根系的生長發(fā)育狀況與根系分泌物濃度聯(lián)系密切.從本實驗結(jié)果可知，美洲商陸根長的增加有利于根系分泌物濃度的增加，說明根系分泌物與根系生長狀況是相互聯(lián)系的.超積累植物為實現(xiàn)其特異的吸收和積累重金屬的能力，在根系生長和形態(tài)上產(chǎn)生了適應(yīng)性的反應(yīng),這種特有的根系形態(tài)特征可能是其超量積累重金屬的重要機(jī)制之一.

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡妙珍,劉鵬,徐根娣,等.鉬、錳營養(yǎng)對大豆碳氮代謝的影響[J].土壤學(xué)報,2008,45(1):180-183.

[2]曾曙才,蘇志堯,陳北光.植物根際營養(yǎng)研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,27(6):79-83.

[3]Reeves R D,Baker A J M.Phytoremediationof Toxic Metals′ Using Plants to Clean Up the Environment[C].New York:John Wiley & Sons,2000.

[4]薛生國,陳英旭,林琦,等.中國首次發(fā)現(xiàn)的錳超積累植物——商陸[J].生態(tài)學(xué)報,2003,23(5):935-937.

[5]任立民,劉鵬,蔡妙珍,等.水蓼、小飛蓬、杠板歸和美洲商陸對錳毒的生理響應(yīng)[J].水土保持學(xué)報,2007,23(3):81-85.

[6]沈宏,嚴(yán)小龍.根分泌物研究現(xiàn)狀及其在農(nóng)業(yè)環(huán)境中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境,2003,16(3):51-54.

[7]洪常青,聶艷麗.根系分泌物及其在植物營養(yǎng)中的作用[J].生態(tài)環(huán)境,2003,12(4):508-511.

[8]唐秀梅,龔春風(fēng),劉鵬,等.鐵錳營養(yǎng)失衡對商陸根系分泌物的影響[J].水土保持學(xué)報,2008,22(6):78-80.

[9]張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2003:127-128.

[10]文樹基.基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1994:53-190.

[11]張海燕,范哲峰.運城鹽湖十種耐鹽植物體內(nèi)無機(jī)及有機(jī)溶質(zhì)含量的比較研究[J].生態(tài)學(xué)報,2002,22(3):352-358.

[12]Yuan Min,Tie Boqing,Tang Meizhen,et al.Accumuiation and uptake of manganese in a hyperaccumulatorPhytolaccaamericana[J].Minerals Engineering,2007,20(2):188-190.

[13]徐根娣,孫文良,劉鵬,等.美洲商陸營養(yǎng)器官的解剖結(jié)構(gòu)與其耐錳的關(guān)系[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008:31(4):452-456.

[14]Schwartz C,Morel J L,Saumier S,et al.Root development of the zinc-hyperaccumulator plantThlaspicaerulescensas affected by metal origin,content and localization in soil[J].Plant and Soil,1999,208:103-115.

[15]Whiting S N,Leake J R,Mc Grath S P,et al.Positive responses to Zn and Cd by roots of the Zn and Cd hyperaccumulatorThlaspicaerulescens[J].New Phytol,2000,145:199-210.

[16]Peng Kejian,Luo Chunling,You Wuxin,et al.Manganese uptake and interactions with cadmium in the hyperaccumulator—PhytolaccaamericanaL.[J].Journal of Hazardous Materials,2008,154(1/2/3):674-681.

[17]陳平平.根的分泌物及其生理作用[J].生物學(xué)通報,1988(8):21-22.

[18]Kr?mer U,Cotter-Howells J D,Charnock J M,et al.Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel[J ].Nature,1996,379:635-638.

[19]施積炎,陳英旭,林琦,等.根分泌物與微生物對污染土壤重金屬活性的影響[J].中國環(huán)境科學(xué),2004,24(3)：316-319.