鄭樹茂 王華 朱敬先 林元珠 高順強(qiáng)

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科,石家莊 050011;2.河北省中醫(yī)院皮膚科,石家莊 050011)

1 材料與方法

1.1 菌株

林生地霉皮損株與血液株由我科臨床所得,均由中國科學(xué)院微生物研究所鑒定,白地霉標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 試劑

DNA提取所用試劑購自美國 OMEGA公司。PCR試劑引物購自上海生工生物工程公司,GoTaq Green Master Mix,2X購自美國 Promega Corporation.

1.3 主要儀器

生物顯微鏡、低溫變速離心機(jī)、恒溫水浴箱、電子天平、電熱式蒸汽消毒器、紫外可見分光光度計、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.4 DNA模板制備

取不多于 3 mL(<2×107個細(xì)胞)的菌懸液進(jìn)行室溫 4 000 r/min離心 10 min,棄去上清液,加480μL BufferSE,10μL 2-巰基乙醇和 20μL溶菌酶,30℃水浴不少于 30 min。室溫 4 000 r/min離心 5 min沉淀,棄去上清液,加 200μL BufferYL、50 mg玻璃珠,輕搖 5 min將懸浮浮游物轉(zhuǎn)移至另 1個1.5 mL的離心管中,加 200μL的蛋白酶 K,上下混勻,55℃震蕩水浴裂解 1 h。然后加 5μL RNA酶A,搖晃數(shù)次,放置室溫培養(yǎng) 5 min,室溫 10 000 r/min離心 5 min,小心吸取懸浮物到離心管中。加220μL BufferYDL混勻,高速振蕩 15 s,65℃水浴10 min。加 220μL的無水乙醇 (室溫 96% ～100%)混勻,高速振蕩 20 s。將 HibindDNA微量柱套在新的 2 mL收集管中將上述溶液過柱,10 000 r/min離心 1 min,棄去濾液。換新的收集管,加500μL BufferHB洗滌,10 000 r/min離心 1 min,棄去濾液。加 700μL Wash buffer(含乙醇)于微量柱中洗滌,10 000 r/min離心 1 min棄去濾液。再次加 700μL Wash buffer重復(fù)洗滌 1次。最大速度(≥10 000 r/min)空甩離心管,干燥柱子。換新的無核酸酶的 1.5 mL的離心管,加 50～100μL 65℃的 Elution buffer,室溫下孵育 3～5 min,10 000 r/min離心 1 min洗脫。再加 50～100μL 65℃的 E-lution buffer重復(fù)洗脫 1次,最終存于離心管中的即為提取出的 DNA模板。將提取的基因組 DNA 2 μL放在分光光度計上測其含量、濃度及 OD值。

1.5 引物的設(shè)計與合成

選用隨機(jī)引物 AP3(5'-TCGTAGCCAA-3')、隨機(jī)引物 ATG(5'-ATGGATCGGC-3')、隨機(jī)引物 RP2(5'-AAGGATCAGA-3')、隨機(jī)引物 OPA-10(5'-GTGATCGCAG-3')。引物由生工生物工程 (上海)有限公司合成。

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積為 25μL,其中含 12.5μL GoTaq Green Master Mix,2X(2X Green GoTaq Reaction Buffer PH8.5,400μmol/L dATP,400μmol/L dGTP,400μmol/L dCTP,400μmol/L dTTP及 3 mmol/L MgCL2),2μL引物 (25μmol/L),3μL模板 DNA(15μg/μL),雙蒸水補(bǔ)足至總體積 25μL,離心數(shù)秒后上機(jī)循環(huán)。

參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計的循環(huán)參數(shù)略作修改進(jìn)行擴(kuò)增。隨機(jī)引物 RP2、隨機(jī)引物 ATG的循環(huán)條件參照文獻(xiàn)[1]的方案略作修改具體為 94℃ 5 min預(yù)變性,94℃1 min變性,36℃1 min退火,72℃2 min延伸,45個循環(huán),72℃保持 10 min延伸;隨機(jī)引物AP3、隨機(jī)引物 OPA-10循環(huán)條件參照 Williams的方案[2]略作修改具體為 94℃ 5 min預(yù)變性,94℃1 min變性,40℃ 1 min退火,72℃ 2 min延伸,45個循環(huán),72℃保持 10 min延伸。

1.7 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 PCR產(chǎn)物檢測

取 8μL反應(yīng)產(chǎn)物加入含溴化乙啶的 1.5%瓊脂糖凝膠樣品孔中,100 V恒壓下電泳 30 min。電泳完畢,將凝膠移至凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行觀察,照相并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 致病性地霉的種間鑒定

由 4種不同引物對白地霉、林生地霉皮損株和血液株進(jìn)行擴(kuò)增后得到相應(yīng)的電泳條帶,每張圖片從左向右依次為 Marker、白地霉、林生地霉皮損株、林生地霉血液株 (見圖 1～4)。由圖可知,利用不同引物可以擴(kuò)增出大小、數(shù)目不一的 DNA條帶,其中 AP3、OPA-10和 RP2擴(kuò)增的條帶多態(tài)性都比較明顯,分別有 1～5個 DNA片段被擴(kuò)增,分子量在200～1 900 bp之間。不同種真菌的 DNA經(jīng)擴(kuò)增后顯示不同的 DNA帶型,同一模板經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)均產(chǎn)生一致的 DNA帶型,而且不同次提取的同一種不同株真菌的 DNA經(jīng)擴(kuò)增后顯示的主要 DNA帶型也是相同的。

2.2 林生地霉的種內(nèi)鑒定

由 4種不同引物對林生地霉皮損株、林生地霉血液株擴(kuò)增后得到的電泳條帶 (見圖 1～4)來看,分離自不同感染部位的林生地霉皮損株和血液株經(jīng)隨機(jī)引物擴(kuò)增后,分別有 1～5個 DNA片段被擴(kuò)增,其中 AP3、ATG和 RP2擴(kuò)增的條帶多態(tài)性均不明顯,DNA帶型基本一致。對同一模板經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)均產(chǎn)生一致的 DNA帶型。

3 討 論

地霉菌屬于腐物寄生性真菌,在自然界廣泛存在,可自蔬菜、青草、肥料和土壤中分離出來,亦可在正常人的皮膚、黏膜、消化道、痰及糞便中檢出[3-4]。地霉是一種條件致病性真菌,只有當(dāng)機(jī)體免疫力降低時才致感染,可侵犯皮膚黏膜和內(nèi)臟,以支氣管感染最多見,偶可致全身播散性感染,其經(jīng)典代表菌種為白地霉[5]。1979～2009年國內(nèi)共報道有 9例白地霉感染。其中白地霉導(dǎo)致皮膚感染的有 2007年鐘華等[6]報道的 1例先天性免疫缺陷病合并播散性馬爾尼非青霉、白念珠菌及白地霉感染病例。2008年李秀麗等[7]首次報道了白地霉引起陰道炎 2例。而林生地霉為地霉屬中新發(fā)現(xiàn)的 1個種,首次從巴西果蠅和印度柞蠶幼蟲身上分離出[3]。從 2002年起我科先后從 1例膿癬患兒的皮損和 1例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離出林生地霉[8-9],2006年黃文明[10]等從足部潰瘍中再次分離處 1株林生地霉,說明本菌既能引起皮膚地霉病,也可導(dǎo)致系統(tǒng)性感染。

圖 1 引物 AP3對不同地霉擴(kuò)增后的電泳條帶:1.2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)參照物,2.白地霉,3.林生地霉皮損株,4.林生地霉血液株 圖 2 引物ATG對不同地霉擴(kuò)增后的電泳條帶:1.2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)參照物,2.白地霉,3.林生地霉皮損株,4.林生地霉血液株 圖 3 引物 OPA-10對不同地霉擴(kuò)增后的電泳條帶:1.2 000bp標(biāo)準(zhǔn)參照物,2.白地霉,3.林生地霉皮損株,4.林生地霉血液株 圖4 引物RP2對不同地霉擴(kuò)增后的電泳條帶:1.2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)參照物,2.白地霉,3.林生地霉皮損株,4.林生地霉血液株Fig.1 PCR fingerprintsamplified with primer AP3:1.Marker,2 000 bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood Fig.2 PCR fingerprints amplified with primer ATG:1.Marker,2 000 bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood Fig.3 PCR fingerprints amplified with primer OPA-10:1.Marker,2 000 bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood Fig.4 PCRfingerprints amplified with primer RP2:1.Marker,2 000bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood

地霉的常規(guī)鑒定主要是采用鏡檢、分離培養(yǎng)等,依據(jù)形態(tài)、生化特征對其進(jìn)行分類鑒別。因?yàn)榈孛怪胁煌曛g菌落的形態(tài)差異不大,培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)溫度和生長速率對其菌落的形態(tài)、質(zhì)地和色澤的影響也不明顯,臨床在對地霉的鑒定過程中常會遇到一定的困難。另外鏡檢都有分支分隔的關(guān)節(jié)菌絲和關(guān)節(jié)孢子,不易鑒別,常規(guī)鑒定法通常需要 2～4周,費(fèi)時長,菌落易被污染,以致失去鑒定的依據(jù)[11]。

RAPD技術(shù)以其特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡便等特點(diǎn)在真菌病的早期診斷上很有應(yīng)用前景。雖然目前醫(yī)學(xué)界對 RAPD技術(shù)的臨床應(yīng)用價值存在爭議,但對于生長緩慢、培養(yǎng)陽性率不高、鑒定較為困難的地霉來說,RAPD技術(shù)仍不失為一種行之有效的方法,該方法借用的是 PCR技術(shù),無需模板DNA的任何序列信息,不需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切與測序,無需 DNA探針,不涉及 Southern雜交、放射自顯影或其他技術(shù),操作步驟少,實(shí)驗(yàn)周期短,靈敏度高,不受環(huán)境等因素的影響,能在較短的時間內(nèi)對真菌做出準(zhǔn)確的鑒定[12-13]。

運(yùn)用 RAPD技術(shù)對地霉從分子生物學(xué)方面做鑒定,首先要提取其基因組DNA,但真菌 DNA的提取要比細(xì)菌及組織 DNA的提取困難的多,因?yàn)檎婢募?xì)胞壁結(jié)構(gòu)堅固,次生代謝產(chǎn)物豐富,一般方法很難破其壁。目前,真菌 DNA提取的方法很多,主要區(qū)別就是破壁方法的不同,以及破壁后分離核酸、蛋白質(zhì)方面的差異。破壁方法包括氯化芐、酶解制備原生質(zhì)體法和液氮冷凍研磨等化學(xué)裂解法。核酸分離方法包括經(jīng)典的酚、氯仿抽提以及商品化的純化柱、純化膜分離法等。氯化芐、十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)法在真菌 DNA提取中應(yīng)用較廣泛,但上述方法存在試劑毒性大、耗費(fèi)時間長等缺點(diǎn)[14]。機(jī)械研磨法常采用液氮研磨,主要是借助超低溫的液氮使真菌的細(xì)胞壁變脆,再通過研磨破壞細(xì)胞壁使染色體釋放出來。此法需要收集較大量的菌體,在提取時為保證研磨充分常導(dǎo)致染色體 DNA受機(jī)械剪切力過度而形成碎片,操作過程不太容易掌握。

本研究中我們采用 E.Z.N.A.Yeast DNA Kit試劑盒,運(yùn)用酶解法 (Lyticase solution and glass beads)溶細(xì)胞酶破壁,再裂解液進(jìn)一步裂解,最后通過去除雜質(zhì)的 DNA純化過程,完成真菌 DNA提取。該方法的操作簡單,不需要特殊設(shè)備,只需離心機(jī)、恒溫箱等簡單設(shè)備即可完成,而且完全避免了接觸有毒試劑,且經(jīng)過純化過程,提取的基因組DNA其純度和濃度均很高,能很好地滿足 PCR反應(yīng)的要求。

我們在獲得適應(yīng) PCR擴(kuò)增的基因組 DNA的基礎(chǔ)上,選用隨機(jī)引物 AP3、ATG、RP2、OPA-10,采用 RAPD技術(shù),對林生地霉和白地霉的指紋圖譜進(jìn)行比較,從基因型的角度對其進(jìn)行分類鑒別。4種引物擴(kuò)增都可以產(chǎn)生特征性基因指紋,DNA條帶多態(tài)性均比較明顯,其中引物 AP3、OPA-10、RP2擴(kuò)增得到的 DNA條帶可以把白地霉和林生地霉明顯區(qū)別開來。而采用 4種引物對林生地霉皮損株和血液株擴(kuò)增得到的 DNA條帶基本一致,這說明取自不同感染部位的同種不同株林生地霉基因型差異不明顯。為避免假陽性的發(fā)生,我們實(shí)驗(yàn)中的每一組 PCR都設(shè)置了模板空白對照,空白均無產(chǎn)物,而且做了重復(fù)性實(shí)驗(yàn);在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),不同次提取的同一株地霉菌的 DNA經(jīng)擴(kuò)增后顯示相同的DNA帶型,而且同一模板在多次實(shí)驗(yàn)中亦產(chǎn)生一致的DNA帶型。從理論上講,PCR技術(shù)可檢測到單個菌細(xì)胞,因此菌落生長早期即可進(jìn)行檢測,檢驗(yàn)時間可大大縮短,可實(shí)現(xiàn)臨床的早期診斷并能進(jìn)一步指導(dǎo)用藥。

本研究表明,采用 E.Z.N.A.Yeast DNA Kit提取的地霉基因組 DNA可以用于 PCR反應(yīng)。以隨機(jī)引物 AP3、ATG、RP2、OPA-10為基礎(chǔ)的 RAPD技術(shù)是一種理想有效的分子生物學(xué)診斷技術(shù),它通過分析指紋圖譜,從基因型的角度對地霉菌進(jìn)行鑒別,操作簡便、迅速,結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠,便于大規(guī)模使用,特別適合于臨床應(yīng)用。

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