羅君琴 李麗 聶振朋 柯甫志 徐建國(guó) 孫建華

（浙江省柑橘研究所 318020）

“439”橘橙是浙江省柑橘研究所以“溫州甌柑”與“改良橙”為親本雜交育成的柑橘品種，該品種具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、耐粗放管理、果實(shí)風(fēng)味及貯藏性好等優(yōu)點(diǎn)，深受橘農(nóng)喜歡，是一個(gè)有發(fā)展希望的優(yōu)良品種，但美中不足的是，“439”橘橙果實(shí)的種子較多，在一定程度上限制了該品種的發(fā)展。嘗試培育無(wú)籽“439”橘橙對(duì)于進(jìn)一步改良“439”種性及促進(jìn)其更好發(fā)展意義較大。

目前，獲取柑橘三倍體新種質(zhì)的途徑主要有三條：（1）柑橘四倍體品種與二倍體品種雜交育種，篩選獲取優(yōu)良三倍體單株。（2）通過(guò)離體培養(yǎng)柑橘幼胚乳組織誘導(dǎo)再生芽，獲得三倍體植株。（3）利用柑橘田間自然雜交能產(chǎn)生一定比例的三倍體小種子，通過(guò)培育柑橘小種子獲取三倍體新種質(zhì)[1～4]。專家們普遍認(rèn)為重量為正常種子1/3以下的小粒種子，容易培養(yǎng)獲取三倍體植株[1，3]。但天然小種子因胚內(nèi)貯藏養(yǎng)分少，在自然條件下播種繁殖，很難萌發(fā)成苗而獲得三倍體植株。本研究旨在利用植株組培手段，研究探索“439”橘橙小種子胚無(wú)菌離體培養(yǎng)技術(shù)，以克服自然播種繁殖的不足，提高橘橙小種子胚成苗率，為利用天然小種子胚選育“439”橘橙三倍體無(wú)籽新種質(zhì)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)小種子采自浙江省柑橘研究所本部試驗(yàn)站“439”橘橙結(jié)果樹(shù)，選正常種子重量1/3以下且大小基本一致的橘橙小種子進(jìn)行離體無(wú)菌再生培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 無(wú)菌系建立 將試驗(yàn)小種子裝入錐形瓶加洗滌劑搓洗，再流水沖洗30min，盡可能多地去除種子上附著的粘性物質(zhì)。洗凈的種子在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)入事先已滅菌好的錐形瓶，用70%酒精處理30s～40s→無(wú)菌水沖洗→10%次氯酸鈉溶液處理10min～12min→無(wú)菌水沖洗，分A、B兩組進(jìn)行接種。A組去內(nèi)外種皮，取小胚接種于MS培養(yǎng)中；B組小種子不去種皮（含內(nèi)外種皮）。直接種于MS培養(yǎng)基。接種25d后，觀察記錄外植體污染情況，50d后觀察統(tǒng)計(jì)小種子胚芽無(wú)菌萌發(fā)個(gè)數(shù)及成苗率。

1.3 初生芽增殖 待“439”橘橙小種子試管幼苗2～3cm高時(shí)，切取初生苗莖段接種于各增殖培養(yǎng)基（表2），于溫度26℃±1℃，光照12h/d，光強(qiáng)2000lx條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，pH為5.8，蔗糖含量25g/L。接種45d后分別觀察記錄各處理瓶苗新芽萌發(fā)數(shù)量及新芽生長(zhǎng)狀況。并計(jì)算出各培養(yǎng)基處理瓶苗的增殖倍率。

1.4 增殖苗生根 將部分長(zhǎng)勢(shì)良好、高4cm以上的增殖瓶苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基處理（表3），培養(yǎng)25d后觀察統(tǒng)計(jì)各處理瓶苗生根率及根生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種皮對(duì)“439”橘橙小種胚試管無(wú)菌萌發(fā)的影響 “439”橘橙小種子經(jīng)過(guò)相同的消毒處理后，種胚分去種皮和帶種皮兩種狀態(tài)接種于同一批次配制的MS培養(yǎng)基，于26℃±1℃溫度，12h/d光照，2000lx光強(qiáng)條件下培養(yǎng)，接種25d后觀察記錄兩處理外植體污染情況，50d后觀察統(tǒng)計(jì)小種子胚芽無(wú)菌萌發(fā)個(gè)數(shù)及成苗率，結(jié)果如表1所示。

表1 種皮對(duì)“439”橘橙小種胚試管無(wú)菌萌發(fā)的影響

從表1結(jié)果可以看出,相同消毒和培養(yǎng)條件下,帶種皮種胚比去種皮種胚容易污染,試驗(yàn)中去種皮種胚接種培養(yǎng)25d后無(wú)外植體污染，帶種皮種胚培養(yǎng)25d存在15%的污染率。同時(shí)，不難發(fā)現(xiàn)：帶種皮外植體接種后種胚萌發(fā)明顯比去種皮處理晚，且成苗率低。去種皮種胚接種7d胚芽便開(kāi)始萌發(fā)，而帶種皮種胚需39d才開(kāi)始萌發(fā)，這可能與種胚外種皮包裹限制了胚吸收外界營(yíng)養(yǎng)成分或種皮本身含某種生長(zhǎng)抑制成分有關(guān)。綜上可知，柑橘小種子無(wú)菌誘導(dǎo)宜去種皮，以縮短其萌發(fā)誘導(dǎo)周期。

2.2 不同激素配比對(duì)“439”橘橙莖段再生芽誘導(dǎo)的影響 去種皮小胚無(wú)菌培養(yǎng)2周左右，種胚可長(zhǎng)至2～3cm高，此時(shí)便可切取初代苗莖段進(jìn)行增殖試驗(yàn)。增殖試驗(yàn)共6個(gè)處理，每處理20個(gè)莖段。接種后45d,觀察記錄各處理瓶苗新芽萌發(fā)總數(shù)、新芽生長(zhǎng)狀況，同時(shí)計(jì)算增殖倍率，結(jié)果如表2所示。

比較表2中處理1、2、3、4可以得知，BA/NAA激素比例相同時(shí)，BA O.1～0.5mg/L濃度范圍內(nèi),隨著激素濃度的增加,增殖倍率提高。但BA O.5mg/L時(shí)，萌發(fā)的新芽葉色淡綠，長(zhǎng)勢(shì)開(kāi)始走弱，BA 1.0mg/L時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)更弱且增殖倍率也開(kāi)始下降。橘橙莖段再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基BA使用濃度宜控制在O.1～0.5mg/L范圍內(nèi)。另外，再比較處理1和5、處理2和6，在BA、NAA相同使用濃度下，適當(dāng)添加GA，可以在一定程度上增加新芽萌發(fā)，因此當(dāng)柑橘莖段再生芽萌發(fā)率較低時(shí)，可適當(dāng)添加GA，促成新芽形成。2.3不同生根培養(yǎng)基對(duì)“439”橘橙增殖苗的生根效果 當(dāng)繼代苗增殖到一定數(shù)量時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)基本一致、生長(zhǎng)良好、高4cm以上的增殖苗進(jìn)行生根培養(yǎng)試驗(yàn)，生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，4個(gè)不同激素處理的生根培養(yǎng)基均添加0.3g/L活性炭。接種時(shí)切成單株，每處理30株。接種后25d觀察統(tǒng)計(jì)各處理瓶苗生根率及根生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如表3所示。

表3 不同生根培養(yǎng)基對(duì)“439”橘橙增殖苗生根影響

從表3中四個(gè)生根培養(yǎng)基配方可以看出,“439”橘橙增殖苗在 1/2MS+NAA0.3+IBA0.3培養(yǎng)配方中生根最好,生根率可達(dá)83%,其次是1/2MS+NAA0.3配方,生根率80%,繼代苗生根效果尚可。比較四個(gè)生根培養(yǎng)基配方中激素種類，不難發(fā)現(xiàn)，NAA與IBA有協(xié)同增效，共同促進(jìn)生根的作用。

3 小結(jié)

3.1 相同消毒和培養(yǎng)條件下，帶種皮種胚比去種皮種胚外植體接種易污染、萌發(fā)晚且成苗率低，可能與種胚外種皮包裹限制了胚吸收外界營(yíng)養(yǎng)成分或種皮本身含某種生長(zhǎng)抑制成分有關(guān)，柑橘小種子無(wú)菌誘導(dǎo)宜去種皮，以縮短其萌發(fā)誘導(dǎo)周期。

3.2 橘橙莖段再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基BA使用濃度宜控制在0.1～0.5mg/L范圍內(nèi),在此濃度范圍內(nèi),BA/NAA激素比例保持不變時(shí),隨著B(niǎo)A濃度的增加,初生芽增殖倍率提高。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)BA、NAA控制在合理濃度范圍時(shí)，適當(dāng)添加GA，可以在一定程度上促成新芽的萌發(fā)。

3.3 在本試驗(yàn)的四個(gè)生根培養(yǎng)配方中，“439”橘橙增殖在1/2MS+NAA0.3+IBAO.3培養(yǎng)配方中生根最好,其次是1/2MS+NAAO.3配方。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)NAA與IBA有協(xié)同增效，共同促進(jìn)生根的作用。

[1]高峰，張進(jìn)仁，吳安仁,等.離體培養(yǎng)柑橘小胚獲得三倍體植株[J].遺傳,1998,10(6)：9～11

[2]祝進(jìn)，王永清，倪彬.尤力克檸檬小種子離體培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(9)：2573～2574

[3]周今華.從本地早小粒種子獲得三倍體植株的研究[J].浙江柑橘,1984,(3)：47

[4]陳力耕,胡運(yùn)權(quán).從二倍體柑橘獲得三倍體的研究[J].園藝學(xué)報(bào),1981,8(2)：11～13