劉建俊， 郭 兵

（湖南省常德市藥品檢驗(yàn)所，湖南常德 415000）

血栓通注射液為三七總皂苷制成的靜脈注射液，其主要含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1等皂苷，臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防與治療，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中藥成方制劑第二十冊(cè)》［1］，采用比色法測定三七總皂苷的含量，比色法用于定量測定專屬性差、影響因素較多且操作過程復(fù)雜;采用薄層掃描測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，薄層掃描用于定量測定誤差較大、影響因素較多;本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法同時(shí)定量測定血栓通注射液中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的含量，該法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好及回收率高，可為該制劑3種皂苷分別定量測定提供可靠實(shí)驗(yàn)方法，也可用于血塞通注射液等三七制劑中3種皂苷的定量測定。

1 儀器與試藥

SHIMADZU高效液相色譜儀（日本島津），包括SPD-20A工作泵、SPD-M20A DAD檢測器、Lc-solution工作站;三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1（均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇均為色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水。血栓通注射液及陰性對(duì)照樣品均由廣東永康藥業(yè)有限公司和哈爾濱圣泰制藥股份有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 UltimateTMXB C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B:水;檢測波長:203 nm，流速:1.0 mL/min，理論塔板數(shù):按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1計(jì)算均不低于5 000，流動(dòng)相梯度條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 用90%甲醇溶解并制成含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1分別為0.080 2、0.293 88、0.300 6 mg/mL 的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品1 mL（約相當(dāng)于含三七總皂苷35 mg），置50 mL量瓶中，加90%甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取缺三七總皂苷的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測定。結(jié)果供試品中3種皂苷的色譜峰能達(dá)到基線分離，其保留時(shí)間與相應(yīng)對(duì)照品一致，陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處無峰，表明陰性無干擾。結(jié)果見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣 5、10、20、30、50 μL，以實(shí)際進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得各組分的回歸方程見表2。結(jié)果表明該方法在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品 B.供試品 C.陰性樣品 1.三七皂苷R1 2.人參皂苷Rg1 3.人參皂苷Rb1Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substances B.sample C.negative sample 1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Rb1

表2 3組份線性關(guān)系測定結(jié)果Tab.2 Linearity of each component

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品混合溶液20 μL在2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，重復(fù)測定6次，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的RSD分別為:0.23%、0.23%、0.29%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h 測定，結(jié)果三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.31%、0.20%、0.22%，表明供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號(hào)供試品6份，按2.2.2項(xiàng)下同法制備供試品溶液，測定，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1含量的RSD分別為0.24%、0.19%、0.21%，表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密量取200 μL已知含量的同一批號(hào)供試品6份，置50 mL量瓶中分別精密加入一定量另配的對(duì)照品混合溶液，加90%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μL，按外標(biāo)法計(jì)算3種組份含量，并計(jì)算回收率，測定結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

2.3.7 樣品含量測定 按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共4批，同時(shí)配制對(duì)照品混合溶液，各進(jìn)樣20 μL，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算結(jié)果，測定結(jié)果見表4。

3 討論

因3種皂苷極性相差較大，文獻(xiàn)報(bào)道三七制劑中皂苷含量均采用梯度洗脫高效液相色譜法［3-5］，本品如按《中國藥典》2005版一部［2］三七含量測定項(xiàng)下的梯度洗脫，結(jié)果樣品峰形差且人參皂苷Rb1峰與雜質(zhì)峰未完全分離，經(jīng)過反復(fù)改變流動(dòng)相比例及時(shí)間摸索條件，在所選用的梯度洗脫比例下，3種皂苷分離良好，樣品峰型好，分離度良好，且快速準(zhǔn)確，是很理想的條件。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.4 Determination results of samples（n=3）

本實(shí)驗(yàn)采用90%甲醇直接稀釋樣品后進(jìn)樣，操作簡便，雜質(zhì)峰較少，該法亦適用測定血塞通注射液及許多三七制劑中3種皂苷含量。

4批樣品測定結(jié)果表明，3種皂苷含量測定差異不大，3種皂苷是主要藥理活性成分，為保證產(chǎn)品質(zhì)量，建議采用高效液相色譜法測定血栓通注射液含量。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑［S］.第二十冊(cè).1998:113.

［2］中國藥典［S］.一部.2005:323.

［3］姚育端，傅 鈺，蔣 平，等.高效液相色譜法測定三七傷藥片中3 組分的含量［J］.中國藥房，2007，18（3）:206-207.

［4］沈國芳，吳永江，程翼宇.RP-HPLC測定血栓通注射液中四種皂苷的含量［J］. 中國藥學(xué)雜志，2003，38（9）:698-699.

［5］金 濤.高效液相色譜法測定長春紅藥片中人參皂普Rg1的含量［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（12）:1785-1786.