張秀玉 ，孔凡玉，王 靜，張成省，李佰樂 ，楊 斌，管志坤，王秀萍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.山東青島煙草有限公司，青島 266071；4.山東青島煙草有限公司膠南分公司，山東 膠南 266400)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種嗜溫的好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌(G+)，具有廣泛的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，易于商業(yè)化，因此一直是植病生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-5]，其中一些優(yōu)良菌株已被應(yīng)用于生產(chǎn)[6-7]。Bacillus subtilis 在生長(zhǎng)代謝中主要產(chǎn)生抗蛋白的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步探討。生素和抗菌蛋白等拮抗物質(zhì)[8-9]。

從煙草根際土壤分離到一株對(duì)煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有較強(qiáng)拮抗作用的生防細(xì)菌SH7，經(jīng)細(xì)菌常規(guī)及16s rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)煙草青枯病的溫室盆栽試驗(yàn)防效較好，并初步證明了該菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)[10]。筆者對(duì)SH7菌株拮抗蛋白的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

指示菌為煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)，拮抗菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SH7菌株，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離純化。

1.2 方法

1.2.1 最佳培養(yǎng)基篩選 拮抗菌SH7菌株最適液體培養(yǎng)基從NA，ATCC，LB，BPY，TYG等[11]中篩選。pH7.0，28 ℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h；以菌體生長(zhǎng)量，抗菌蛋白含量及其抑制青枯病菌的活性為指標(biāo)，確定菌株產(chǎn)抗菌蛋白的最佳培養(yǎng)基。每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2 菌體生長(zhǎng)量測(cè)定 將培養(yǎng)完后的菌體培養(yǎng)液稀釋成不同的濃度梯度，吸取100 μL均勻涂布在NA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24 h；觀察菌體狀況和測(cè)量菌落數(shù)，計(jì)算出菌體生長(zhǎng)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 抗菌蛋白粗提取 培養(yǎng)液于8000 r/min離心10 min去菌體，取100 mL上清液，冰浴、攪拌緩慢滴加硫酸銨，直到上清液達(dá)到90%的硫酸銨飽和度，4 ℃靜置過夜；12000 r/min 4 ℃離心10 min取沉淀，沉淀用0.02 mol/LTris-HCL緩沖液(pH7.2)溶解，置于透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3500)中，用同濃度的緩沖液透析去鹽即得到抗菌蛋白粗提液，檢測(cè)抑菌活性。蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定按照文獻(xiàn)[12]。

1.2.4 抗菌活性測(cè)定 采用牛津杯擴(kuò)散法法。將指示菌煙草青枯病菌懸液加入50 ℃ NA固體培養(yǎng)基中倒平板，將待測(cè)的活性物質(zhì)注入孔內(nèi)，每個(gè)牛津杯注入150 μL，28 ℃下培養(yǎng)24 h，以不接種SH7菌株的相同培養(yǎng)基按1.2.2方法提取蛋白作空白對(duì)照，觀察抑菌狀況并測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 以最佳培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，通過分別改變培養(yǎng)基的初始pH(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、裝液量(250 mL三角瓶每瓶裝50, 75, 100, 125, 150, 175 mL)、培養(yǎng)溫度(22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36 ℃)、培養(yǎng)時(shí)間(12, 24, 36, 48,60, 72, 84, 96, 108 h)和搖床轉(zhuǎn)速(130, 150, 170, 190,210, 230 r/min)，按方法1.2.2測(cè)菌體生長(zhǎng)量，按方法1.2.3 提取抗菌蛋白并檢測(cè)其濃度，按1.2.4方法檢測(cè)抑菌活性；以菌體生長(zhǎng)量、抗菌蛋白含量及其抑制青枯病菌的活性為指標(biāo)，來(lái)確定該菌種產(chǎn)抗菌蛋白的最佳培養(yǎng)條件。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 抗菌蛋白粗提物特性測(cè)定 用pH為2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10的鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二鈉-檸檬酸、Tris-CL及硼砂緩沖液代替水，將粗提拮抗蛋白分別調(diào)至不同pH；將抗菌蛋白粗液分別于20, 40, 60,80, 100, 121 ℃處理20 min；分別按1.2.3方法檢測(cè)抑菌活性，每孔加入150 μL的處理液，以未經(jīng)處理抗菌蛋白粗液作對(duì)照，24 h后觀察抑菌狀況和測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.7 室內(nèi)防效測(cè)定 待煙草(NC89)株高為20 cm時(shí)，設(shè)2個(gè)處理：1)同時(shí)注射抗菌蛋白粗提液和煙草青枯病菌；2)注射煙草青枯病菌為空白對(duì)照。在煙草第2片真葉的葉腋處將菌液注射到莖內(nèi)維管束部位，抗菌蛋白粗提液質(zhì)量濃度0.10 mg/mL，菌液濃度均為1×108cfu/mL，每株煙草注射0.5 mL，每處理30株煙草。于注射煙草青枯病菌后第30天調(diào)查發(fā)病情況。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)SH7菌株及其抗菌蛋白的影響

2.1.1 培養(yǎng)基種類 不同液體培養(yǎng)基對(duì)SH7菌株產(chǎn)抗菌蛋白量及其抑菌活性、菌株生長(zhǎng)的影響如表1。NA培養(yǎng)基可產(chǎn)較多抗菌蛋白且活性相對(duì)較高，抑菌圈直徑達(dá)22.4 mm，蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度達(dá)0.116 mg/mL，同時(shí)NA培養(yǎng)基也利于菌體的生長(zhǎng)，菌體量為8.0×108cfu /mL，所以NA培養(yǎng)基最適宜于SH7菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)抑菌蛋白。

表1 培養(yǎng)基對(duì)抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Table1 Effects of medium on inhibition ability, antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.2 起始pH 由表2可看出，SH7在中性及堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，能產(chǎn)生抑菌蛋白，而在中性環(huán)境對(duì)菌體的生長(zhǎng)、抗菌蛋白的產(chǎn)生及積累最為有利。在pH6.0時(shí)，產(chǎn)生較多的抗菌活性物質(zhì)，抗菌蛋白相對(duì)含量較高，表現(xiàn)的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為23.1 mm，蛋白質(zhì)含量為0.162 mg/mL，菌體量為6.3×108cfu /mL，故pH6.0最適。

表2 pH對(duì)抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Table2 Effects of different pH on inhibition ability,antagonistic protein of SH7and its growth

2.1.3 裝液量 從表3得知，SH7在不同的裝液量下均能生長(zhǎng)且產(chǎn)生抗菌蛋白，但裝液量過多或過少均不利于菌體的生長(zhǎng)，從而影響抗菌蛋白的產(chǎn)生。裝液量100 mL時(shí)菌體生長(zhǎng)量、抗菌蛋白含量和抑菌活性最高，菌體量為5.8×109cfu/mL，抑菌圈直徑達(dá)21.7 mm，蛋白質(zhì)含量為0.148 mg/mL，裝液量100 mL為最適。

表3 裝液量對(duì)抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Table3 Effects of medium volume on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.4 培養(yǎng)溫度 從表4得知，在26 ℃和28 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)量和產(chǎn)生蛋白量相差很少，而26 ℃時(shí)抑菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)比28 ℃時(shí)高，即產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)較多，抑菌圈直徑達(dá)17.6 mm，故最適溫度為26 ℃。

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間 從表5得知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌體的增長(zhǎng)量與蛋白的產(chǎn)生量呈正比關(guān)系。96 h時(shí)菌體生長(zhǎng)量和蛋白含量達(dá)到最大值，分別為：2.3×1011cfu/mL, 0.214 mg/mL。且在96 h時(shí)抑菌圈直徑最大為21.6 mm，即此時(shí)具有活性的抑菌蛋白含量最多，故96 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

表4 培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Table4 Influence of culture temperature on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

表5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Table5 Influence of culture time on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.6 轉(zhuǎn)速 不同轉(zhuǎn)速下，菌體生長(zhǎng)的通氣量不同，從而影響菌體的生長(zhǎng)。從表6可知，在170 r/min時(shí)蛋白含量和菌體生長(zhǎng)量均達(dá)到最大值，分別為：0.159 mg/mL, 8.7×109cfu/mL，此時(shí)抑菌圈直徑也最大為18.8 mm，故170 r/min為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

2.2 抗菌蛋白粗提物特性

抑菌蛋白粗提液經(jīng)20～60 ℃處理20 min后抑菌活性基本保持不變，80 ℃處理20 min后抑菌活性稍微下降，100 ℃和121 ℃處理20 min后分別保持抑菌活性的83.1%和68.0%，說明該抑菌蛋白的熱穩(wěn)定性較好。

常溫(28 ℃)下測(cè)定得，在pH中性及偏堿性范圍內(nèi)，抗菌蛋白粗提液保持大部分抑菌活性，而在酸性環(huán)境中基本沒有抑菌活性。pH為2.0, 3.0, 4.0時(shí)其抑菌活性接近 0；pH5.0時(shí)其抑菌活性仍保持32%；pH6.0和7.0時(shí)其抑菌活性仍保持100%；pH8.0,9.0, 10.0時(shí)其抑菌活性分別為89%, 86%, 88%，說明該抑菌蛋白的中性及堿穩(wěn)定性比較好。

2.3 室內(nèi)防效效果

注射抗菌蛋白粗提液對(duì)煙草青枯病能起到較好的防治效果，防效達(dá)70.8%，其發(fā)病率為29.2%；空白對(duì)照發(fā)病率為92.10%。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室分離的SH7是一株枯草芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)證實(shí)SH7菌株對(duì)煙草具有促生作用，對(duì)其他作物青枯病菌、煙草黑脛病和煙草赤星病菌具有良好的拮抗作用，且已分離純化出具有抑菌活性的蛋白，其分子量是33.6 kD(另文報(bào)道)。本次實(shí)驗(yàn)用充分鹽析后的硫酸銨沉淀物進(jìn)行一系列的溫度處理，在20～60 ℃處理 20 min后活性基本保持不變，100℃和121 ℃處理20 min后分別仍保持抑菌活性的83.1%, 68.0%；該抑菌蛋白在pH為9.0, 10.0時(shí)其抑菌活性仍分別為86%, 88%，說明對(duì)熱、堿性條件穩(wěn)定，可與一些堿性藥劑一起施用。從最佳培養(yǎng)時(shí)間的篩選中可以看出，在一定時(shí)間范圍中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，蛋白含量與菌體生長(zhǎng)量成正比。

[1]陳中義，張杰，黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機(jī)制與遺傳改良研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33(2):97-103.

[2]陳志誼，高太東，嚴(yán)大富，等.枯草芽孢桿菌 B2916防治水稻紋枯病的田間試驗(yàn)[J].中國(guó)生物防治，1997，13(2)：75-78.

[3]Sturz A V, Christie B R, Nowak J.Bacterial endophytes:Potential role in developing sustainable systems of crop production [J].Critical Reviews in Plant Sciences, 2000,19(1): 1-30.

[4]Raupach G S, Kloepper J W.Mixtures of plant growthpromoting rhizobacteria enhance biological control of multiple cucumber pathogens [J].Photopathology, 1998,88(11): 1158-1164.

[5]隋文志，丁麗俐，吳魁斌.枯草芽孢桿菌 HB248防病增產(chǎn)效果研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè), 1995(3):4-5.

[6]Baker K F.Evolving concepts of biological control of plant pathogens [J].Ann Rev Phytopathol, 1987, 25:67-85.

[7]Asaka O，Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Baccilus subtilis RB14 [J].App1 Environ Microbiol, 1996, 62 (11): 4081-4085

[8]Moyne A-L, Cleveland T E, Tuzun S.Molecular characterization and analysis of the operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D [J].FEMS Microbiology Letters, 2004, 234: 43-49.

[9]Ahimou F, Jacques P, Deleu M.Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hydrophobicity [J].Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27: 749-754.

[10]王靜, 趙廷昌，孔凡玉，等.SH7對(duì)煙草青枯病的抑菌、防病作用及其抑菌物質(zhì)的初步研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)2007，28(2): 41-44.

[11]中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì).中國(guó)菌種目錄[M].北京：輕工業(yè)出版社，1983: 404-422.

[12]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.