趙美瞇，趙金生，高青華，何桂林，郝麗英

（中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽 110001）

心肌電生理學(xué)是心臟電學(xué)的重要組成部分，開創(chuàng)于20世紀(jì)的40~50年代［1］，隨著膜片鉗制技術(shù)的發(fā)展及其在心肌細(xì)胞上的應(yīng)用，特別是以鈣離子內(nèi)流為主的慢內(nèi)向電流的發(fā)現(xiàn)，帶動(dòng)了心肌電生理學(xué)的進(jìn)一步深入發(fā)展。心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的研究是心肌電生理學(xué)研究必要的第一步。1964年Trautwein第一次用雙電極電壓鉗制技術(shù)在犬的Purkinje纖維上記錄出了心肌細(xì)胞的離子流，Hamill等［2］改進(jìn)了Neher和Sakmann的膜片鉗技術(shù)［3］，使其能夠適用于心肌細(xì)胞電流的記錄，20世紀(jì)80年代研究者發(fā)現(xiàn)并闡明了心肌細(xì)胞各種主要離子流的基本特性，特別是發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)纖維所不具有的慢內(nèi)向鈣電流。

在心肌細(xì)胞標(biāo)本方面，Kono等［4］建立了用膠原酶和胰蛋白酶分離大鼠心肌細(xì)胞的方法，取代了以往的機(jī)械分離方法。Yazawa等［5］采用膠原酶等也分離出了豚鼠的心室肌細(xì)胞。然而，如何獲得有效而穩(wěn)定的心肌細(xì)胞卻一直困擾著心肌電生理學(xué)研究者。本研究在以往方法的基礎(chǔ)上對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞分離方法進(jìn)行了摸索及完善，并記錄觀察了所獲細(xì)胞的動(dòng)作電位和代表性離子流鈣電流的基本特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性豚鼠，體質(zhì)量300~400 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試 劑 ：NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaOH，KOH，NaH2PO4，KH2PO4，Glucose 和 Taurine 均為國產(chǎn)市售分析純?cè)噭?，Glutamic acid和HEPES購自Amresco公司，K-Aspartate購自日本 TCI公司，K2ATP和Na2CrP購自Sigma公司，EGTA購自日本DOJINDO公司，Protease購自Sigma公司，Collagenase購自日本 Yakult公司（Lot No：208054）。

1.1.3 溶液配制：臺(tái)式液（Tyrodessolution，mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 5.5，CaCl21.8，用氫氧化鈉調(diào) pH 至 7.4。無鈣臺(tái)氏液（Ca2+-free tyrodessolution）：未加CaCl2的臺(tái)式液。電極內(nèi)液（electrode internal solution，mmol/L）：K-Aspartate 110，KCl 30，MgCl21，K2ATP 5，Na2CrP 5，HEPES5，EGTA 10，CaCl21.43（pCa 8），用氫氧化鉀調(diào)pH至7.2。液接電位約為10 mV。KB液（Kraftbrühe-modified solution，mmol/L）：Glutamic acid 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，Glucose 10，HEPES10，EGTA 0.5，MgCl23，用 KOH 調(diào) pH 至 7.4。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離：豚鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉110 mg/kg麻醉后，仰臥位固定。行氣管插管，接上小動(dòng)物呼吸機(jī)給予正壓人工呼吸（潮氣量4 ml，60次/min，呼氣∶吸氣為3∶1）。用止血鉗在2、3肋間隙與胸骨交界處打開胸腔，充分暴露心臟和升主動(dòng)脈。進(jìn)行原位主動(dòng)脈插管，固定插管。游離心臟后置于Langendorff裝置進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌流。先用臺(tái)式液灌流約3 min，再用無鈣臺(tái)式液灌流約 6 min，然后用含膠原酶（濃度 0.06～0.08 mg/ml）的無鈣臺(tái)式液消化8～18 min，最后用KB液沖洗殘酶約5 min。整個(gè)灌流系統(tǒng)用恒溫水浴保持在37℃，所有液體均用純氧飽和。灌流完畢，取下心臟，放入室溫的KB液中剪碎心室肌，輕涮得到單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)105μm的鋼絲膜濾過后，置于含蛋白酶（0.05 mg/ml）的KB液中37℃水浴均勻振蕩4 min。離心3次（800 r/min，3 min）去除殘留酶，最后置于 4℃的KB液中靜置1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 膜片鉗全細(xì)胞記錄：取細(xì)胞懸液加入倒置顯微鏡（日本Olympus公司）灌流浴槽中，待細(xì)胞沉底后用臺(tái)式液慢慢灌流復(fù)鈣10～20 min。待心室肌細(xì)胞貼壁呈靜息狀態(tài)，在臺(tái)式液灌流（0.5～2 ml/min）狀態(tài)下，開始膜片鉗全細(xì)胞記錄實(shí)驗(yàn)。玻璃微電極（美國Fisher公司）由P-97（美國Sutter公司）分4步拉制而成。利用三維操縱器移動(dòng)電極，最終輕輕貼在細(xì)胞表面。輕輕給予負(fù)壓形成高阻封接，繼續(xù)施加負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄模式。信號(hào)經(jīng)Pt電極引導(dǎo)，由Axopatch 200B膜片鉗放大器（美國Axon公司）放大，通過Digidata 1440數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（美國Axon公司），由計(jì)算機(jī)pClamp10軟件采集數(shù)據(jù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 分離細(xì)胞的形態(tài)學(xué)

用臺(tái)式液緩慢灌流復(fù)鈣后，存活的單個(gè)心室肌細(xì)胞達(dá)50%～70%；部分細(xì)胞鈣負(fù)載后自發(fā)性收縮，短時(shí)間內(nèi)縮成團(tuán)塊死亡（圖1A）。高倍鏡下可見，存活細(xì)胞形態(tài)良好，呈桿狀或柱狀，具有清晰的橫紋（圖1B）。本方法分離所得的心室肌細(xì)胞在KB液中保存10 h以上仍可存活，適用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

2.2 分離細(xì)胞的動(dòng)作電位

形成全細(xì)胞記錄方式后，在電流鉗模式下，給予4 nA×3 ms電流刺激，誘發(fā)出心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位（圖2）。其靜息電位（-69.9±3.4）mV；幅度（158.0±4.6）mV；復(fù)極到50%時(shí)的動(dòng)作電位時(shí)程（action potential durationat50%of repolarization，APD50）為（189.2±40.3）ms；復(fù)極到95%時(shí)的動(dòng)作電位時(shí)程（action potential durationat95%ofrepolarization，APD95）為（313.1±38.9）ms（n ＝ 9）。

2.3 分離細(xì)胞的L型鈣通道電流

2.3.1 全細(xì)胞記錄L型鈣通道電流：形成全細(xì)胞記錄模式后，在電壓鉗狀態(tài)下，由-40 mV的保持電位去極化到0 mV，刺激電壓持續(xù)200 ms，此時(shí)記錄到一個(gè)緩慢失活的內(nèi)向電流，即為L(zhǎng)型鈣通道電流（圖3）。其電流峰值為（-466.3±35.0）pA（n=10）。

2.3.2 L型鈣通道電流的電流-電壓（I-V）曲線：在電壓鉗狀態(tài)下，以10 mV步階使心室肌細(xì)胞由-40 mV逐步去極化到+50 mV，刺激電壓持續(xù)300 ms，保持電位-40 mV，此時(shí)記錄到一系列的電流（圖4），作IV曲線（圖5）。結(jié)果顯示，當(dāng)膜電位去極化至0～10 mV，鈣通道電流達(dá)峰值。其反轉(zhuǎn)電位值為（43.5±1.2）mV（n ＝8）。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法獲得的心室肌細(xì)胞具有較好的耐鈣性，基本避免了心肌細(xì)胞在正常鈣濃度外液中因鈣反常［6～9］現(xiàn)象而導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡的問題。從膜靜息電位和動(dòng)作電位結(jié)果看，具有正常心室肌細(xì)胞的興奮性。豚鼠心室肌離子通道分布及動(dòng)作電位形態(tài)與人相似，具有明顯的2相平臺(tái)期。它主要由緩慢內(nèi)向電流鈣電流及外向電流延遲整流鉀電流共同形成［10］，而大鼠的心室肌細(xì)胞上因缺少外向電流延遲整流鉀電流，沒有明顯的平臺(tái)期［11］。鈣電流記錄結(jié)果顯示，所獲心室肌細(xì)胞具有典型的L型鈣離子通道功能，適用于膜片鉗電生理研究。關(guān)于全細(xì)胞鈣電流記錄，可通過在細(xì)胞外液中加入河豚毒素阻斷鈉通道，得到一個(gè)緩慢內(nèi)向電流。而本實(shí)驗(yàn)中選用正常臺(tái)式液作為細(xì)胞外液，保持電位在-40 mV，同樣也記錄到典型L型鈣通道電流，且更接近正常生理環(huán)境，保持心肌細(xì)胞正常形態(tài)，更有利于封接。

本實(shí)驗(yàn)中我們總結(jié)影響分離所得細(xì)胞產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素如下：（1）在體游離心臟，行主動(dòng)脈逆行插管：與以往的直接開胸摘出心臟的方法相比較，配合人工呼吸的在體主動(dòng)脈逆行插管，可避免手術(shù)中心肌細(xì)胞缺血缺氧［12］。操作難點(diǎn)是主動(dòng)脈插管的深度把握，若插管過深通過主動(dòng)脈瓣進(jìn)入左心室，灌流液不能很好地流入冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)，直接進(jìn)入心室造成內(nèi)壓增高，使心內(nèi)膜以至整個(gè)心臟都無法得到良好的灌注，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量降低，且大多為死亡細(xì)胞。（2）注意膠原酶的消化時(shí)間：膠原酶消化之前，無鈣臺(tái)式液灌流約6 min。若灌流時(shí)間過短，脫鈣不完全，冠脈未處于完全舒張狀態(tài)，會(huì)影響膠原酶溶液灌流，從而影響心肌細(xì)胞消化；相反，若時(shí)間過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間處于無鈣環(huán)境中又會(huì)引起“鈣反?！保?3］。本實(shí)驗(yàn)采用單一膠原酶消化，易控制消化程度。根據(jù)豚鼠體重和灌流液流速適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短消化時(shí)間，即可達(dá)到相同的消化效果。此外，應(yīng)注意酶的生產(chǎn)廠家，生產(chǎn)批號(hào)不同，酶的活性也可能不同。若更換新酶或新批號(hào)，應(yīng)注意根據(jù)酶活性大小適當(dāng)調(diào)節(jié)酶的劑量。（3）微量蛋白酶處理細(xì)胞表面：在過濾后細(xì)胞懸液中加入微量蛋白酶，可減少細(xì)胞表面的糖被層，達(dá)到單細(xì)胞分散效果，更有利于膜片鉗實(shí)驗(yàn)中電極與細(xì)胞膜之間形成高阻封接［14］。（4）KB液保存：細(xì)胞保存在高鉀的KB液中，可顯著延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間，研究表明保存其中的細(xì)胞具有正常電生理特性［15］。在本實(shí)驗(yàn)中使用KB液保存的細(xì)胞在復(fù)鈣沖洗后其數(shù)量和電生理活性均可支持完成膜片鉗實(shí)驗(yàn)，并在保存液中可存活達(dá)10 h。（5）水質(zhì)等其他重要因素：實(shí)驗(yàn)中所用灌流液均用Milli-Q水配制，其電阻值≥18 MΩ。膠原酶在適當(dāng)溫度下才能發(fā)揮最大活性，因此需用循環(huán)恒溫水浴保證灌流溫度于37℃。整個(gè)灌流系統(tǒng)要排盡氣泡，避免空氣栓塞等導(dǎo)致冠脈局部不暢、周邊心肌細(xì)胞死亡。灌流液需通氧氣飽和，減輕灌流消化過程中引起的細(xì)胞缺氧甚至死亡。實(shí)驗(yàn)中對(duì)上述各方面細(xì)節(jié)的嚴(yán)格控制是獲得穩(wěn)定及反應(yīng)性良好細(xì)胞的關(guān)鍵。

總之，本方法分離所得豚鼠心室肌細(xì)胞具有正常的離子通道功能，適用于膜片鉗技術(shù)對(duì)心肌電生理特性的研究。本實(shí)驗(yàn)操作易于掌握，是一種簡(jiǎn)單有效的急性分離心室肌細(xì)胞的方法。

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